| CRISPR/Cas9-mediated ssDNA Recombineering in Corynebacterium glutamicum
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Corynebacterium glutamicum is a versatile workhorse for industrial bioproduction of many kinds of chemicals and fuels, notably amino acids. Development of advanced genetic engineering tools is urgently demanded for systems metabolic engineering of C. glutamicum. Recently unveiled clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and their CRISPR-associated proteins (Cas) are now revolutionizing genome editing. The CRISPR/Cas9 system from Streptococcus pyogenes that utilizes NGG as protospacer adjacent motif (PAM) and has good targeting specificity can be developed into a powerful tool for efficient and precise genome editing of C. glutamicum. In this protocol, we described the general procedure for CRISPR/Cas9-mediated ssDNA ...
[摘要] 谷氨酸棒杆菌是多种化学品和燃料，特别是氨基酸的工业生物生产的多功能工具。 迫切需要开发先进的基因工程工具用于 C的系统代谢工程。谷氨酸。 最近推出的聚集的有规律的间隔短回文重复序列（CRISPR）和它们的CRISPR相关蛋白（Cas）现在正在彻底改变基因组编辑。 来自 Streptococcus pyogenes 的CRISPR / Cas9系统利用NGG作为原型间隔区相邻基序（PAM）并具有良好的靶向特异性，可以开发成为 C的高效和精确基因组编辑的有力工具。谷氨酸。 在该方案中，我们描述了 C中CRISPR / Cas9介导的ssDNA重组工程的一般程序。谷氨酸。 可以在 C中引入小的修改。 谷氨酸染色体，编辑效率高达90％。
【背景】革兰氏阳性土壤细菌 Corynebacterium glutamicum 是用于氨基酸，生物燃料和聚合物构建模块的工业生物生产的多功能工具（Becker et al。，2016）。在 C工程的早期阶段。谷氨酸，随机诱变结合对氨基酸类似物的表型抗性的阳性选择是最常用的策略（Vertes et al。，2005）。 C中的遗传操作。谷氨酸（glutamicum）于1984年启动，并成为菌株改良的关键促成策略（Ozaki et al。，1984）。常规使用的基因破坏和插入 ...
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| Targeted Genome Editing of Virulent Phages Using CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] This protocol describes a straightforward method to generate specific mutations in the genome of strictly lytic phages. Briefly, a targeting CRISPR-Cas9 system and a repair template suited for homologous recombination are provided inside a bacterial host, here the Gram-positive model Lactococcus lactis MG1363. The CRISPR-Cas9 system is programmed to cleave a specific region present on the genome of the invading phage, but absent from the recombination template. The system either triggers the recombination event or exerts the selective pressure required to isolate recombinant phages. With this methodology, we generated multiple gene knockouts, a point mutation and an insertion in the genome of the virulent lactococcal phage p2. Considering the broad host range of the plasmids used ...
[摘要] 该协议描述了一个直接的方法来产生严格裂解噬菌体的基因组中的特定突变。 简而言之，在细菌宿主（此处为革兰氏阳性模型乳酸乳球菌MG1363）内提供靶向CRISPR-Cas9系统和适合于同源重组的修复模板。 CRISPR-Cas9系统被编程为切割入侵噬菌体的基因组上存在的特定区域，但是缺少重组模板。 该系统触发重组事件或施加分离重组噬菌体所需的选择性压力。 利用这种方法，我们在毒性乳酸球菌噬菌体p2的基因组中产生了多个基因敲除，点突变和插入。 考虑到本协议中使用的质粒的广泛宿主范围，后者可以外推到其他噬菌体 - 宿主对。
【背景】噬菌体是在每个生态系统中发现丰富的细菌病毒（Suttle，2005; Breitbart and Rohwer，2005），毫不奇怪，它们是牛奶的天然居民。噬菌体p2是乳品工业中发现的强毒乳球菌噬菌体的最普遍组（ Sk1virus ）的模型（Deveau等人，2006; Mahony等人。，2012），它感染革兰氏阳性细菌乳酸乳球菌MG1363，也是基础研究的模式菌株。尽管p2作为参照噬菌体的地位，但几乎一半的基因编码未表征的蛋白质。同样，由宏基因组学确定的绝大多数噬菌体基因在公共数据库中没有功能分配和同系物（Hurwitz等人，2016; Paez-Espino等人， 2016）。
研究基因的方法之一是通过修饰和随后观察所得到的表型。噬菌体基因组只能在宿主内以其生物活性形式进行修饰。强毒噬菌体严格裂解;因此，它们的基因组从未整合到细菌染色体中。这为DNA的体内修饰增加了一个时间限制，只能在短的感染周期内对其进行操作。 ...
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| In vitro Antigen-presentation Assay for Self- and Microbial-derived Antigens
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Antigen presenting cells (APC) are able to process and present to T cells antigens from different origins. This mechanism is highly regulated, in particular by Patter Recognition Receptor (PRR) signals. Here, I detail a protocol designed to assess in vitro the capacity of APC to present antigens derived from bacteria, apoptotic and infected apoptotic cells.
[摘要] 抗原呈递细胞（APC）能够处理和呈递来自不同来源的T细胞抗原。这种机制是高度调节的，特别是通过Patter Recognition Receptor（PRR）信号。在这里，我详细说明了一种设计用于评估体外的APC方案，用于展示来源于细菌，凋亡和感染的凋亡细胞的抗原。
背景 T细胞淋巴细胞在其表面上表达T细胞受体（TCR），其允许识别作为与主要组织相容性复合物（MHC）分子结合的抗原加工和呈递的抗原的细胞（自身）或微生物（非自身）抗原）呈递细胞（APC）。 APC能够处理抗原并将其呈递给T细胞，并且MHC-TCR相互作用是感染和自身免疫应答期间T细胞活化的关键步骤。
＆NBSP;以前的作品已经描述了基于刺激模式识别受体（PRR），例如toll样受体（TLR）（Blander和Medzhitov，2004和2006）的抗原呈递的调节机制。实际上，特异性地来自含有微生物病原体的吞噬体的TLR信号有利于在MHC-II分子内呈递非自身抗原。另一方面，凋亡细胞吞噬后产生的自身抗原由于不存在TLR刺激而导致溶酶体降解。然而，当两者都来自感染的凋亡细胞并且同时由相同的吞噬体携带时，自身和非自身抗原的分离不会发生，其由针对抗原呈递的TLR信号最佳地定制。已经使用骨髓来源的树突状细胞（BMDC）和凋亡性小鼠B细胞 - ...
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