Mapping mRNA-18S rRNA Contacts Within Translation Initation Complex by Means of Reverse Transcriptase Termination Sites and RNAseq
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] The nucleotides involved in RNA-RNA interaction can be tagged by chemical- or UV-induced crosslinking, and further identified by classical or modern high throughput techniques. The contacts of mRNA with 18S rRNA that occur along the mRNA channel of 40S subunit have been mapped by site-specific UV crosslinking followed by reverse transcriptase termination sites (RTTS) using radioactive or fluorescent oligonucleotides. However, the sensitivity of this technique is restricted to the detection of those fragments that resulted from the most frequent crosslinkings. Here, we combined RTTS with RNAseq to map the mRNA-18S rRNA contacts with a much deeper resolution. Although aimed to detect the interaction of mRNA with the ES6S region of 18S rRNA, this technique can also be applied to map the ...
[摘要] [摘要 ] 可以通过化学或紫外线诱导的交联来标记参与RNA-RNA相互作用的核苷酸,并通过经典或现代的高通量技术对其进行进一步鉴定。沿着40S亚基的mRNA通道发生的18S rRNA与mRNA的接触已通过位点特异性UV交联进行了定位,随后使用放射性或荧光寡核苷酸进行了逆转录酶终止位点(RTTS)。但是,该技术的敏感性仅限于检测由最频繁的交联产生的那些片段。在这里,我们将RTTS与RNAseq结合使用,以更深的分辨率绘制了mRNA-18S rRNA接触图。尽管旨在检测mRNA与18S rRNA的ES6S区域的相互作用,但该技术也可以用于绘制mRNA与其他非编码RNA分子的相互作用(在转录,剪接或RNA介导的转录后调控过程中(例如,snRNA,microRNA和lncRNA)。
[背景 ] 是与非编码RNA的mRNA的相互作用volved mRNA中的生命周期的每个步骤,从它的生物合成和处理进入细胞核至细胞质中的翻译和最终降解。这些相互作用可以在大分子机器核糖体和剪接体,以及在较小的复合物如RISC或者发生(RNA诱导的沉默复合物)或lncRNA介导的基因表达调节期间(皮萨列夫等人,2008; Engreitz 。等人,2014 Sharma ...
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Isolation of Murine Brain and Lung Microvascular Endothelial Cells
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Date:
2018-08-20
[Abstract] This protocol describes how to isolate murine endothelial cells from newborn mice brain and 3-month-old mice lung by modifying the original protocols (Sobczak et al., 2010; Ruck et al., 2014). We have used the protocol to analyze mRNA expression level in brain endothelial cells (Sawaguchi et al., 2017). Isolated lung endothelial cells were expanded in vitro for various downstream experiments such as gene expression analysis and cell-based signaling assay.
[摘要] 该协议描述了如何通过修改原始方案从新生小鼠脑和3个月大的小鼠肺中分离鼠内皮细胞(Sobczak et al。,2010; Ruck et al。,2014)。 我们使用该方案分析脑内皮细胞中的mRNA表达水平(Sawaguchi et al。,2017)。 分离的肺内皮细胞在体外扩增用于各种下游实验,例如基因表达分析和基于细胞的信号传导测定。
【背景】 该方案描述了从小鼠脑和肺中分离鼠内皮细胞的实验程序。 我们使用新生小鼠使用抗CD31抗体分离脑内皮细胞。 使用该方案,可以从脑内皮细胞中分离出适合于基因表达分析的2μg总RNA,尽管不能完全消除周细胞和星形胶质细胞。 我们还使用3个月大的小鼠肺使用抗CD31和抗CD102抗体分离肺内皮细胞。 将分离的肺内皮细胞在体外6cm培养皿中扩增,并用于各种下游实验,例如基因表达分析和基于细胞的信号传导测定。
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Protocol for Notch-ligand Binding Assays Using Dynabeads
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This protocol describes how to measure interaction between Notch receptors and their ligands by cell-based assay using Dynabeads. We have used the protocol to determine binding capacity between Notch1-transfected HEK293T cells and ligand-coated Dynabeads. Expression of Eogt in Notch1-expressing cells promoted binding toward DLL4-coated beads, but not JAG1-coated beads. The Notch-ligand assay using Dynabeads suggested that Eogt facilitates DLL4-Notch1 interaction (Sawaguchi et al., 2017).
[摘要] 该协议描述了如何使用Dynabeads通过基于细胞的测定来测量Notch受体及其配体之间的相互作用。 我们已经使用方案来确定Notch1转染的HEK293T细胞和配体包被的Dynabeads之间的结合能力。 在Notch1表达细胞中表达Eogt 促进了对DLL4包被的珠粒的结合,而不是JAG1包被的珠粒。 使用Dynabeads的Notch-配体测定表明,Eogt 有助于DLL4-Notch1相互作用(Sawaguchi等人,2017)。 【背景】Notch信号通路调节许多类型的细胞事件,如所有后生动物中的增殖,细胞命运测定和细胞分化(Mumm和Kopan,2000)。为了启动Notch信号传导,Notch受体的细胞外结构域与其配体结合,呈现在相对细胞上的Delta样(DLL)配体或Jagged(JAG)配体)。
Notch受体的表皮生长因子(EGF)样结构域对配体结合至关重要,并由包含O-岩藻糖,O-葡萄糖和O-GlcNAc聚糖的特定聚糖修饰(Stanley和Okajima,2010)。这些聚糖中的一些通过调节Notch受体和配体之间的物理相互作用(Moloney等人,2000)用作Notch信号传导途径的调节剂。为了研究O-GlcNAc是否调节Notch-配体相互作用,我们开发了一种基于Dynabeads的Notch-配体结合测定。在该测定中,在HEK293T细胞上表达的Notch受体与用DLL4-Fc或JAG1-Fc包被的Dynabeads蛋白A孵育。与用于其他结合测定法的可溶性配体不同,Notch配体的方向固定在珠上,使得它们表现得像配体表达细胞。因此,检测到的结合表示反式结合而不是顺式结合,当Notch受体及其配体在相同的细胞中表达时发生。该测定表明,通过Eogt ...
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