| Enzymatic Synthesis and Fractionation of Fluorescent PolyU RNAs
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] The physical properties of viral-length polyuridine (PolyU) RNAs, which cannot base-pair and form secondary structures, are compared with those of normal-composition RNAs, composed of comparable numbers of each of A, U, G and C nucleobases. In this protocol, we describe how to synthesize fluorescent polyU RNAs using the enzyme polynucleotide phosphorylase (PNPase) from Uridine diphosphate (UDP) monomers and how to fractionate the polydisperse synthesis mixture using gel electrophoresis, and, after electroelution, how to quantify the amount of polyU recovered with UV-Vis spectrophotometry. Dynamic light scattering was used to determine the hydrodynamic radii of normal-composition RNAs as compared to polyU. It showed that long polyU RNAs behave like linear polymers for which the radii scale ...
[摘要] 将不能碱基配对并形成二级结构的病毒长度聚尿苷（PolyU）RNA的物理性质与正常组成RNA的物理性质进行比较，正常组成RNA由相当数量的A，U，G和C核碱基组成。 在该协议中，我们描述了如何使用来自二磷酸尿苷（UDP）单体的酶多核苷酸磷酸化酶（PNPase）合成荧光polyU RNA以及如何使用凝胶电泳分离多分散合成混合物，并且在电洗脱后，如何量化 用UV-Vis分光光度法回收polyU。 与polyU相比，动态光散射用于确定正常组成RNA的流体动力学半径。 结果表明，长polyU RNA的行为类似于线性聚合物，其半径范围为链长为N 1/2 ，而正常组成RNA则作为紧凑的支链RNA，其半径范围为 如N 1/3 。
【背景】 PolyU作为物理对象： PolyU是一种由重复的尿苷残基组成的非生物RNA分子，因此，它不能与Watson-Crick碱基对缺乏RNA二级结构（Martin和Ames，1962; Richards et al。，1963）。 PolyU具有非常弱的碱基堆积能量，导致缺乏螺旋排序 - 除了低于4°C（Richards et al。，1963）。由于缺乏这种结构，polyU ...
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| Single Genome Sequencing of Expressed and Proviral HIV-1 Envelope Glycoprotein 120 (gp120) and nef Genes
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] The current study provides detailed protocols utilized to amplify the complete HIV-1 gp120 and nef genes from single copies of expressed or integrated HIV present in fresh-frozen autopsy tissues of patients who died while on combined antiretroviral therapy (cART) with no detectable plasma viral load (pVL) at death (Lamers et al., 2016a and 2016b; Rose et al., 2016). This method optimizes protocols from previous publications (Palmer et al., 2005; Norström et al., 2012; Lamers et al., 2015; 2016a and 2016b; Rife et al., 2016) to produce single distinct PCR products that can be directly sequenced and includes several cost-saving and time-efficient modifications.
[摘要] 目前的研究提供了详细的方案，用于扩增完整的HIV-1 gp120和nef基因，从单个拷贝的表达或综合的HIV存在于新鲜冷冻尸检组织中，在联合抗逆转录病毒治疗（cART）而死亡的患者中，没有可检测的血浆病毒 死亡时负荷（pVL）（Lamers等，2016a和2016b; Rose等，2016）。 该方法优化了以前的出版物（Palmer等，2005;Norström等，2012; Lamers等，2015; 2016a和2016b; Rife等，2016）的方案，以产生可以直接的单独不同的PCR产物 测序并包括若干成本节约和时间有效的修改。
【背景】三十多年前，艾滋病毒感染及其临床表现，即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），已成为全球流行病。此后，对艾滋病病毒发病机制的认识已经出现，药物治疗的发展显着延长了患者的生命。目前的cART方案包括以几种方式抑制病毒复制的各种药物，其允许几乎完全抑制血液中发现的病毒颗粒和恢复健康的CD4 + T细胞群体（CD4 +）（Autran等人，1997 ）。然而，cART治疗患者血浆中持续存在非常低水平的艾滋病毒，即使是经过数十年治疗的患者，也表明存在一种以病毒为基础的细胞库。病毒储库包含不释放感染性病毒（即被潜在感染）的感染细胞，但可以在活化后进行，这可能在各种条件下发生（Chun等，1995和1997）。 ...
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