| Determination of Flavin Potential in Proteins by Xanthine/Xanthine Oxidase Method
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] This protocol describes a simple xanthine/xanthine oxidase enzymatic equilibration method for determination of the redox potential of a flavin. As an example of the use of this method, we determine the reduction potential of the covalently bound FAD cofactor (Em = -55 mV) in the SdhA flavoprotein subunit of succinate dehydrogenase from Escherichia coli. In principle, this method can be used routinely to determine the redox potential of flavin cofactors in any simple flavoprotein from equilibrium concentrations with an appropriate reference dye of known Em without the use of sophisticated electrochemical equipment.
[摘要] [摘要] 该协议描述了一种简单的黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶酶平衡方法，用于测定黄素的氧化还原电位。作为使用此方法的一个例子，我们确定了大肠杆菌中琥珀酸脱氢酶的SdhA 黄素亚基中共价结合的FAD辅因子的还原电位（E m = -55 mV）。原则上，该方法可常规用于通过平衡浓度和已知E m 的适当参考染料确定任何简单黄素蛋白中黄素辅因子的氧化还原电位。 无需使用复杂的电化学设备。
[背景] 几种生物物理方法可用于测量蛋白质中黄素的还原中点电位（E m ）。这些电位测量方法通常依赖于目标蛋白质和电极之间的电化学偶联。例如，在带有其他辅助因子（例如铁硫中心和醌）的复杂黄素蛋白中，常常使用电化学方法和电子顺磁共振（EPR）光谱来确定氧化还原中心的E m （Kowal 等，1995；Saenger等，等人，2005； Hudson 等人，2005； Cheng 等人，2015）。然而，在只包含黄素氧化还原中心简单黄素蛋白，辅助因子，可以直接通过它不需要特殊的设备电化学或昂贵的EPR仪表传统光学分光光度法研究。1990年，文森特·梅西（Vincent Massey）提出了一种简单的方法，该方法可以从氧化和还原伴侣（即黄素蛋白和参考染料）的平衡浓度中确定黄素的还原电位（Massey，1991）。该方法不直接测量黄素的还原电势，而是确定黄素和参考染料的E m ...
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| Fluorophore Labeling, Nanodisc Reconstitution and Single-molecule Observation of a G Protein-coupled Receptor
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Activation of G protein-coupled receptors (GPCRs) by agonist ligands is mediated by a transition from an inactive to active receptor conformation. We describe a novel single-molecule assay that monitors activation-linked conformational transitions in individual GPCR molecules in real-time. The receptor is site-specifically labeled with a Cy3 fluorescence probe at the end of trans-membrane helix 6 and reconstituted in phospholipid nanodiscs tethered to a microscope slide. Individual receptor molecules are then monitored over time by single-molecule total internal reflection fluorescence microscopy, revealing spontaneous transitions between inactive and active-like conformations. The assay provides information on the equilibrium distribution of inactive and active receptor conformations and ...
[摘要] 通过激动剂配体激活G蛋白偶联受体（GPCR）是通过从无活性受体构象向活性受体构象的转变来介导的。我们描述了一种新颖的单分子测定法，可以实时监测单个GPCR分子中的激活连锁构象转换。受体在跨膜螺旋6末端用Cy3荧光探针进行位点特异性标记，并在连接到显微镜载玻片的磷脂纳米圆盘中重构。然后通过单分子全内反射荧光显微镜随时间监测单个受体分子，显示无活性和活性样构象之间的自发转变。该测定提供关于无活性和活性受体构象的平衡分布以及构象交换的速率常数的信息。实验可以在不存在配体的情况下进行，显示负责基础信号传导活动的自发构象过渡，或者存在激动剂或反向激动剂配体，揭示配体如何改变受体的动力学刺激或抑制信号传导活性。所得到的机械信息对于改进的GPCR靶向药物的设计是有用的。单分子测定法在β2肾上腺素能受体的背景下进行了描述，但可扩展到多种GPCRs。
【背景】GPCR介导本地和远距离的细胞通讯，特别是内分泌系统。例如，细胞对激素如肾上腺素的反应是通过肾上腺素能受体介导的，其中β2肾上腺素能受体（β2AR）是突出的成员。 ...
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