| Overcoming Autofluorescence to Assess GFP Expression During Normal Physiology and Aging in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Green fluorescent protein (GFP) is widely used as a molecular tool to assess protein expression and localization. In C. elegans, the signal from weakly expressed GFP fusion proteins is masked by autofluorescence emitted from the intestinal lysosome-related gut granules. For instance, the GFP fluorescence from SKN-1 transcription factor fused to GFP is barely visible with common GFP (FITC) filter setups. Furthermore, this intestinal autofluorescence increases upon heat stress, oxidative stress (sodium azide), and during aging, thereby masking GFP expression even from proximal tissues. Here, we describe a triple band GFP filter setup that separates the GFP signal from autofluorescence, displaying GFP in green and autofluorescence in yellow. In addition, yellow fluorescent protein ...
[摘要] 绿色荧光蛋白（GFP）被广泛用作评估蛋白质表达和定位的分子工具。在 C中。线虫，来自弱表达的GFP融合蛋白的信号被肠溶酶体相关肠道颗粒发出的自发荧光掩盖。例如，使用常见的GFP（FITC）过滤器设置几乎看不到融合到GFP的SKN-1转录因子的GFP荧光。此外，这种肠自发荧光在热应激，氧化应激（叠氮化钠）和衰老过程中增加，从而甚至从近端组织掩蔽GFP表达。在这里，我们描述了一个三频段GFP滤波器设置，将GFP信号与自发荧光分开，显示绿色GFP和黄色自发荧光。此外，黄色荧光蛋白（YFP）仍然可以与黄色自发荧光和GFP区别开来，这种三重带滤光器设置。虽然使用三频段GFP过滤器设置可能会损失一些GFP强度，但优点是不需要修改当前使用的转基因GFP系列，并且这些GFP过滤器易于安装。因此，通过使用这种三重带GFP过滤器设置，研究人员可以轻松地将自发荧光与其最喜欢的转基因 C中的GFP和YFP区分开来。线虫线。
【背景】自发荧光的主要来源包括细胞内溶酶体衍生的颗粒，线粒体（即，自发荧光分子如NAD（P）H和黄素）或细胞外胶原蛋白（Hermann 等。 ，2005; Monici，2005）。在老化过程中，自发荧光材料如脂褐素和晚期糖基化终产物（AGE）积聚。在线虫 C.线虫，肠道颗粒的自发荧光在胚胎发生过程中已经开始，反映了溶酶体相关细胞器的生物发生（Hermann ...
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| Culturing Bacteria from Caenorhabditis elegans Gut to Assess Colonization Proficiency
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Determining an accurate count of intestinal bacteria from Caenorhabditis elegans is one critical way to assess colonization proficiency by a given bacteria. This can be accomplished by culturing appropriate dilutions of worm gut bacteria on selective or differential agarized media. Because of the high concentration of bacteria in gut worm, dilution is necessary before plating onto growth media. Serial dilutions can reduce the concentration of the original intestinal sample to levels low enough for single colonies to be grown on media plates, allowing for the calculation of the initial counts of bacteria in the intestinal sample.
[摘要] 从秀丽隐杆线虫确定肠道细菌的准确计数是评估给定细菌的定殖能力的关键方法之一。 这可以通过在选择性或差异琼脂培养基上培养适当稀释的蠕虫细菌来实现。 由于肠蠕虫中细菌的浓度高，因此稀释必须在生长培养基上。 连续稀释可以将原始肠样品的浓度降低到足够低的浓度，使单个菌落生长在培养基平板上，从而计算肠样品中细菌的初始计数。
【背景】动物很少分离生活，但与微生物有关。主要与微生物之间的共生关系是Rosentberg和Zilber-Rosenberg在2011年的共生关系。在哺乳动物中，宿主 - 微生物共生相互作用主要发生在粘膜表面，最重要的是肠粘膜。当从野生新鲜分离时，线虫通常在其肠腔内容纳多种细菌菌群，使人联想到高等生物的微生物群落（Duveau和Felix，2012; Bumbarger等，2013）。相比之下，在实验室中，秀丽隐杆线虫通常保持在单一细菌菌株的存在下（Brenner，1974）。大多数情况下，这是革兰氏阴性细菌大肠杆菌。然而，有时使用其他物种，例如革兰氏阳性枯草芽孢杆菌（Garsin等，2003）。成虫蠕虫含有大约10,000个细菌细胞，比宿主蠕虫体细胞数量高10倍（Portal-Celhay和Blaser，2012）：或许巧合的是，这种微生物群与宿主细胞的比例与人类发现的相似。
正在使用不同的策略来测量秀丽隐杆线虫的细菌如异硫氰酸荧光素（FITC）标记的细菌，表达融合报告基因的细菌（绿色荧光蛋白[GFP]或β-半乳糖苷酶））的定殖能力。然而，更准确的方法是测量从蠕虫肠分离出的CFU的数量。在本协议中，我们展示了如何分离和计数秀丽隐杆线虫的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌菌株。在枯草芽孢杆菌的情况下，我们还展示了如何区分营养形式与秀丽隐杆线虫内部这种细菌形成的高度抗性孢子。 ...
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