| A High-throughput Assay for mRNA Silencing in Primary Cortical Neurons in vitro with Oligonucleotide Therapeutics
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Primary neurons represent an ideal cellular system for the identification of therapeutic oligonucleotides for the treatment of neurodegenerative diseases. However, due to the sensitive nature of primary cells, the transfection of small interfering RNAs (siRNA) using classical methods is laborious and often shows low efficiency. Recent progress in oligonucleotide chemistry has enabled the development of stabilized and hydrophobically modified small interfering RNAs (hsiRNAs). This new class of oligonucleotide therapeutics shows extremely efficient self-delivery properties and supports potent and durable effects in vitro and in vivo. We have developed a high-throughput in vitro assay to identify and test hsiRNAs in primary neuronal cultures. To simply, rapidly, ...
[摘要] 原代神经元是鉴定用于治疗神经变性疾病的治疗性寡核苷酸的理想细胞系统。然而，由于原代细胞的敏感性，使用经典方法转染小干扰RNA（siRNA）是费力的，并且通常显示低效率。寡核苷酸化学的最新进展使得稳定和疏水修饰的小干扰RNA（hsiRNA）的发展成为可能。这种新型的寡核苷酸治疗剂显示出非常有效的自我传递性质，并且在体外和体内支持有效和持久的效果。我们开发了高通量的体外测定法来鉴定和测试原代神经元培养物中的hsiRNA。为了简单，快速，准确地量化数百个hsiRNA的mRNA沉默，我们使用QuantiGene 2.0定量基因表达测定法。这种高通量，96孔板测定法可以直接从样品裂解液中定量mRNA水平。在这里，我们描述了一种制备96孔板格式的小鼠原代皮质神经元的短期培养物用于寡核苷酸治疗剂的高通量测试的方法。该方法支持在短短两周内测试hsiRNA文库和鉴定潜在的治疗方法。我们详细介绍了从初级神经元准备到数据分析的高通量测定工作流程的方法。该方法可以帮助鉴定用于治疗各种神经疾病的寡核苷酸治疗剂。
【背景】寡核苷酸治疗剂代表了通过沉默突变蛋白的表达，可以靶向任何遗传定义的病症的新一类药物。具体地，siRNA是负载于RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的双链寡核苷酸，并且可以在mRNA翻译之前使mRNA沉默。然而，未修饰的siRNA是不稳定的，并且不能在没有阳离子脂质制剂的帮助下进入细胞，其可能对原代细胞如神经元有毒性。在本协议中，我们使用自我递送，疏水修饰的siRNA（hsiRNA）进行mRNA沉默。最近在寡核苷酸化学方面的进展使得这些稳定的hsiRNA的设计促进了细胞内化，有效进入RISC以及有力击倒靶基因（Byrne等，2013; ...
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| Optogenetic Stimulation and Recording of Primary Cultured Neurons with Spatiotemporal Control
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] We studied a network of cortical neurons in culture and developed an innovative optical device to stimulate optogenetically a large neuronal population with both spatial and temporal precision. We first describe how to culture primary neurons expressing channelrhodopsin. We then detail the optogenetic setup based on the workings of a fast Digital Light Processing (DLP) projector. The setup is able to stimulate tens to hundreds neurons with independent trains of light pulses that evoked action potentials with high temporal resolution. During photostimulation, network activity was monitored using patch-clamp recordings of up to 4 neurons. The experiment is ideally suited to study recurrent network dynamics or biological processes such as plasticity or homeostasis in a network of neurons ...
[摘要] 我们研究了文化中的皮层神经元网络，并开发了一种创新的光学装置，以空间和时间精确度激发大量神经元。 我们首先描述如何培养表达channelorhodopsin的原代神经元。 然后，我们将根据快速数字光处理（DLP）投影机的工作原理来详细说明光遗传设置。 该设置能够用独立的光脉冲训练数十到数百个神经元，以高时间分辨率诱发动作电位。 在光刺激期间，使用多达4个神经元的膜片钳记录监测网络活动。 该实验非常适合研究复杂的网络动力学或生物过程，如神经元网络中的可塑性或体内平衡，当子群体由其特征（相关性，速率和大小）进行精细控制的不同刺激激活时。
【背景】光致遗传学提供以毫秒精度控制神经元活动的平均值。然而，神经元通常通过同时激活整个群体的光的闪光或通过在整个视野上的时间调制强度的光同时激活（Boyden等人，2005）。然而，存在几种空间调节光并已被用于使谷氨酸不起作用的方法（Nawrot等人，2009）或激活表达神经元的通道视紫质（ChR2）（Guo等人，2009）（用于审查刺激神经元的可用方法具有空间和时间分辨率参见Anselmi等人，2015）。
为了获得刺激的空间控制，第一种可能性是使用激光并将其光束快速移动到不同位置。例如，通过用声光偏转器偏转激光束已经实现了在不同树枝状位置处的谷蛋白解冻（Shoham等人，2005）。只有我们在有限的区域内足够缓慢地调节光强度，这个策略才可能是可行的。或者，可以使用相位或强度的光调制器来实现光的空间图案。基于相位调制的全息技术允许以三维空间精度获得图像，但是可以以仅100Hz的速率显示图案（Papagiakoumou等人，2010）。如果二维图案是足够的，则可以通过将投影仪或阵列的LED放置在样品的共轭平面中来简单地获得强度调制（Farah等人，2007; ...
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| Loading of Extracellular Vesicles with Chemically Stabilized Hydrophobic siRNAs for the Treatment of Disease in the Central Nervous System
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Efficient delivery of oligonucleotide therapeutics, i.e., siRNAs, to the central nervous system represents a significant barrier to their clinical advancement for the treatment of neurological disorders. Small, endogenous extracellular vesicles were shown to be able to transport lipids, proteins and RNA between cells, including neurons. This natural trafficking ability gives extracellular vesicles the potential to be used as delivery vehicles for oligonucleotides, i.e., siRNAs. However, robust and scalable methods for loading of extracellular vesicles with oligonucleotide cargo are lacking. We describe a detailed protocol for the loading of hydrophobically modified siRNAs into extracellular vesicles upon simple co-incubation. We detail methods of the workflow from ...
[摘要] 将寡核苷酸治疗剂即siRNAs有效递送到中枢神经系统代表了治疗神经系统疾病的临床进展的显着障碍。 小的内源性细胞外囊泡显示能够在细胞（包括神经元）之间传输脂质，蛋白质和RNA。 这种天然的贩运能力使细胞外囊泡成为寡核苷酸即siRNA的递送载体的潜力。 然而，缺乏用寡核苷酸载体装载细胞外囊泡的稳健和可扩展的方法。 我们描述了在简单共孵育后将疏水修饰的siRNA加载到细胞外囊泡中的详细方案。 我们详细介绍了从细胞外囊泡纯化到数据分析的工作流程。 该方法可以促进基于细胞外基于囊泡的疗法用于治疗广泛的神经障碍。
【背景】siRNA是一种类型的寡核苷酸治疗剂，一类新的直接靶向信使RNA（mRNA）的药物，以防止导致疾病表型的蛋白质的表达。 siRNA的治疗应用是非常有希望的，因为siRNA可以被设计为靶向任何基因，包括不能用小分子或基于蛋白质的疗法“可药用”的基因。在寡核苷酸治疗剂的化学中取得的进展使得能够设计完全稳定的疏水改性的siRNA（hsiRNA，用2'-O-甲基或2'-氟以及硫代磷酸酯和共价键合到胆固醇的有义链修饰），其促进细胞hsiRNA的自我内化，并保持有效负载在RNA诱导的沉默复合体（RISC）中的能力（Byrne等，2013; Khvorova和Watts，2017）。与乘客链的3'末端连接的胆固醇缀合物对于快速细胞膜缔合是必需的（Byrne等，2013; ...
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