Nuclear Transformation of Chlamydomonas reinhardtii by Electroporation
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is an important model organism for studying photosynthesis, acclimation to abiotic stress, cilia biology, and many other biological processes. Many molecular biology tools exist for interrogating gene function including the ability to easily transform the nuclear genome of Chlamydomonas. While technical advances such as TALENs, ZFNs and CRISPR are making it easier to precisely edit the nuclear genome, the efficiency of such methods in Chlamydomonas is at present very low. In contrast, random insertion by nuclear transformation tends to be a much more efficient process. This protocol describes a method for transformation of the Chlamydomonas nuclear genome by electroporation. The protocol requires at ...
[摘要] 单细胞绿藻莱茵衣藻是研究光合作用,适应非生物胁迫,纤毛生物学和许多其他生物过程的重要模式生物。 许多分子生物学工具用于询问基因功能,包括轻松转化衣藻的核基因组的能力。 虽然TALENs,ZFNs和CRISPR等技术进步正在使精确编辑核基因组变得更加容易,但此类方法在衣原体中的效率目前非常低。 相反,通过核转变随机插入往往是一个更有效的过程。 该协议描述了通过电穿孔转化衣原体核基因组的方法。 该协议需要至少3天的工作,并通常导致1-2周内出现小菌落。
【背景】众多的分子,遗传和基因组资源使得莱茵衣藻(以下简称衣衣属)成为研究各种生物过程的优秀模式生物。已经开发了许多技术来改变衣藻核,叶绿体和线粒体,包括粒子轰击(Boynton等,1988),玻璃珠转化(Kindle,1990)和电穿孔(Shimogawara等人,1998)。核衣壳菌可通过将衣藻暴露于物理或化学诱变剂(例如紫外线或甲磺酸乙酯)而产生,但通常通过随机插入诱变转基因DNA而获得。由于衣藻核转化的同源重组效率非常低(Zorin等人,2009; Jinkerson和Jonikas,2015),转化的DNA通常整合到核基因组随机位点。存在许多用于随后鉴定异位DNA的插入位点的技术,包括经典遗传作图(Rymarquis等人,2005),TAIL-PCR(Dent等人 ...
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Dense sgRNA Library Construction Using a Molecular Chipper Approach
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Genetic screens using single-guide-RNA (sgRNA) libraries and CRISPR technology have been powerful to identify genetic regulators for both coding and noncoding regions of the genome. Interrogating functional elements in noncoding regions requires sgRNA libraries that are densely covering, and ideally inexpensive, easy to implement and flexible for customization. We present a Molecular Chipper protocol for generating dense sgRNA libraries from genomic regions of interest. This approach utilizes a combination of random fragmentation and a Type III restriction enzyme to derive a dense coverage of sgRNA library from input DNA.
[摘要] 使用单导向RNA(sgRNA)文库和CRISPR技术的遗传筛选功能强大可以识别基因组编码区和非编码区的遗传调控因子。 在非编码区域中询问功能元件需要密集覆盖的sgRNA文库,理想的便宜,易于实现和灵活定制。 我们提出了一个分子切片方案从感兴趣的基因组区域产生密集的sgRNA文库。 该方法利用随机断裂和III型限制酶的组合从输入DNA导出sgRNA文库的致密覆盖。 【背景】使用化脓性链球菌(sp)的基因组编辑Cas9和sgRNA文库是通过产生双重缺失功能序列改变来筛选哺乳动物细胞功能性遗传调节因子的有力工具(Wiedenheft et al。,2012; Mali et al。,2013; Koike-Yusa等,2014; Shalem等,2014; Wang等,2014; Zhou等,2014)。 Cas9结合sgRNA,其可被设计为将Cas9靶向基因组中定义的基因座。 Cas9的核酸酶活性切割靶DNA位点,导致双链DNA断裂,在通过非同源末端连接途径进行DNA修复时,经常导致感兴趣的基因座短缺失。 CRISPR-Cas9系统强大的基因组编辑能力导致使用sgRNA文库来询问蛋白质编码基因以及非编码区域。通过sgRNA富集功能筛选,报告了几种用于蛋白质编码基因和/或有限数量的非编码基因的sgRNA文库,以鉴定调控特定细胞功能的基因和网络(Koike-Yusa等,2014; ...
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