| Investigating Localization of Chimeric Transporter Proteins within Chloroplasts of Arabidopsis thaliana
|
|
Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] In this protocol, we describe a method to design chimeric proteins for specific targeting to the inner envelope membrane (IEM) of Arabidopsis chloroplasts and the confirmation of their localization by biochemical analysis. Specific targeting to the chloroplast IEM can be achieved by fusing the protein of interest with a transit peptide and an IEM targeting signal. This protocol makes it possible to investigate the localization of chimeric proteins in chloroplasts using a small number of transgenic plants by using a modified method of chloroplast isolation and fractionation. IEM localization of chimeric proteins can be further assessed by trypsin digestion and alkaline extraction. Here, the localization of the chimeric bicarbonate transporter, designated as SbtAII, is detected by ...
[摘要] 在这个协议中，我们描述了一种设计嵌合蛋白的方法，用于特异性靶向拟南芥叶绿体的内包膜（IEM）并通过生化分析确定它们的定位。 叶绿体IEM的特异性靶向可通过将感兴趣的蛋白质与转运肽和IEM靶向信号融合来实现。 这个协议使得有可能使用少量的转基因植物，通过使用修改的叶绿体分离和分离方法来研究嵌合蛋白在叶绿体中的定位。 嵌合蛋白的IEM定位可以通过胰蛋白酶消化和碱性提取进一步评估。 在此，称为SbtAII的嵌合碳酸氢根转运蛋白的定位通过使用针对葡萄球菌蛋白A的抗体进行蛋白质印迹来检测。该方案改编自上原等人，2016年
【背景】有人提出将蓝藻CO 2浓度机制整合到叶绿体中是改善C 3+植物光合作用的有希望的方法。 根据理论估计，将BicA和SbtA整合到叶绿体IEM中可以提高光合CO 2固定率。 我们研究了核编码的蓝细菌碳酸氢盐转运蛋白BicA和SbtA与拟南芥叶绿体的IEM的整合。 因此，我们制定了一个协议，设计嵌合构造为特定目标的IEM和调查嵌合蛋白在叶绿体中的定位。
|
|
|
| Generation of Chemically Induced Liver Progenitors (CLiPs) from Rat Adult Hepatocytes
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Primary mature hepatocytes (MHs) or their progenitor cells are candidate cell sources for cell transplantation therapy in severe liver diseases. However, stable culture of these cells or generation of equivalent cells from pluripotent stem cells has been limited. Using a cocktail of small molecules that we previously found useful in stable culture of multiple types of stem/progenitor cells, we recently established a novel method to generate bipotent liver progenitor cells, named chemically induced liver progenitors (CLiPs), from adult rat MHs. Here, we describe a detailed protocol for the induction of rat CLiPs. We first describe the method to isolate primary rat MHs and then describe how to induce CLiPs from these MHs. In addition, we describe a method to evaluate the bipotentiality of ...
[摘要] 原代成熟肝细胞（MH）或其祖细胞是重症肝病中细胞移植治疗的候选细胞来源。然而，这些细胞的稳定培养或多能干细胞的等效细胞的产生受到限制。我们使用先前在多种类型的干/祖细胞稳定培养中发现有用的小分子混合物，最近建立了一种从成年大鼠MHs产生双能肝脏祖细胞（命名为化学诱导肝祖细胞（CLiPs））的新方法。在这里，我们描述了诱导大鼠CLiPs的详细方案。我们首先描述分离原代鼠MH的方法，然后描述如何从这些MH中诱导CLiPs。另外，我们描述了一种评估产生的CLiPs分化成肝细胞和胆管上皮细胞的双能性的方法。我们还介绍了如何通过长期的文化和详细的示例数据建立稳定的CLiP。可以在2周内产生初级CLiPs，并且可以在2.5-4个月内建立经历10次传代的稳定的CLiPs，批次间变异性。
【背景】对于实现肝病再生医学的新型细胞来源有着强烈的需求。目前唯一的治疗终末期肝病的方法是肝移植，但是由于供者短缺，其应用受到限制。最近，我们小组提出了一种产生能够在体外稳定地扩增的新型LPC的方法，并且可以以广泛的效率重新繁殖慢性肝炎动物模型的损伤肝脏（Katsuda等人， / ...
|
|
|
| Phototaxis Assay for Chlamydomonas reinhardtii
|
|
Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Phototaxis is a behavior in which organisms move toward or away from the light source (positive or negative phototaxis, respectively). It is crucial for phototrophic microorganisms to inhabit under proper light conditions for phototaxis. The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii rapidly changes its swimming direction upon light illumination, and thus is a nice model organism for phototaxis research. Here we show two methods to assay Chlamydomonas phototaxis; one is a quick, easy and qualitative analysis, so-called the dish assay; and the other is a quantitative single-cell analysis.
[摘要] 光趋向性是一种生物朝向或远离光源（分别为正或负光趋势）移动的行为。 光合微生物在光照条件适宜的条件下居住是至关重要的。 单细胞藻类莱茵衣藻在光照下迅速改变其游泳方向，因此是光线研究的一个很好的模型生物。 我们在这里展示了两种测定衣藻感染的方法; 一个是快速，容易和定性的分析，所谓的盘测定; 另一个是定量单细胞分析
【背景】单细胞藻类莱茵衣藻被用作各种研究领域的示范生物，包括微生物光合作用，光合作用和睫毛/鞭毛运动（Hegemann and Berthold，2009）。衣藻细胞在其眼窝感觉到光，观察细胞器作为位于细胞赤道附近的橙色斑点。眼窝包含位于细胞膜中的光感受器蛋白质通道视紫质和富含类胡萝卜素的颗粒层，其作用于光反射器之后的通道视紫质。由于它们的相对位置，眼睛受到高度定向的光感受，细胞可以准确地检测光照的方向（Foster和Smyth，1980; Ueki等，2016）。在光接收时，两个鞭毛改变它们的跳动平衡，并且细胞改变其游泳方向朝向或远离光源。
衣原体光镜方向（或“符号”）由细胞还原氧化态调节，其受细胞代谢如光合作用和呼吸活动的影响（Wakabayashi等，2011）。因此，光照标记间接地反映了体内的这些活性。例如，显示快速光敏反应的突变体已被证明具有高的光合活性（Kim等，2016）。此外，为了调节鞭毛打击细胞的光动力转动，鞭毛动力蛋白应严格调节（Kamiya和Witman，1984; ...
|
|
|