| Cellulase and Macerozyme-PEG-mediated Transformation of Moss Protoplasts
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] This protocol describes the generation of protoplasts from protonemal tissue of the moss Physcomitrium patens (syn. Physcomitrella patens), using Cellulase ONOZUKA R10 and Macerozyme R10, followed by polyethylene glycol (PEG) mediated transformation. The protonemal tissue grown in liquid suspension was harvested and treated with enzyme cocktails mix of 1.5% Cellulase ONOZUKA R10 and 0.5% Macerozyme R10 to generate 1,8 million protoplasts within 3 h.
[摘要] [摘要]该方案描述从苔藓原丝体的原生质体组织的生成Physcomitrium藓（同义词小立碗藓），使用纤维素酶Onozuka R 10和离析酶R10，随后聚乙二醇（PEG）介导的转化。收获在液体悬浮液中生长的原质组织，并用1.5％Cellulase ONOZUKA R10和0.5％Macerozyme R10的酶混合物混合处理，在3小时内产生180万原生质体。
[背景]由于其在自然同源性定向修复中的效率，Physcomitrium patens非常适合用作植物实验系统，尤其是用于基因的异源表达，从而可以产生具有可预测特性和特征的转化体。此外，P.patens具有低成本培养的优势，并且可以在生物反应器中大量维护（Reski等人，2018）。的基因工程展叶剑叶藓细胞允许大规模生产天然产物和药物如的毒胡萝卜素和其它萜类的候选药物，这是很难的访问（西蒙森等人，2009） 。该协议显示了如何分离和转化从单倍体原生质丝释放的彭定康原生质体。P. patens已被用于原生质体的产生和PEG介导的转化。在之前的实验protoplastation上展叶剑叶藓中与酶进行崩溃酶从担子菌纲（湾。等2009，;巴赫等人，2014） ...
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| Determination of Mn Concentrations in Synechocystis sp. PCC6803 Using ICP-MS
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Manganese (Mn) is an essential micronutrient for all photoautotrophic organisms. Two distinct pools of Mn have been identified in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 (Synechocystis), with 80% of the Mn residing in the periplasm and 20% in cytoplasm and thylakoid lumen (Keren et al., 2002). In this protocol, we describe a method to quantify the periplasmic and intracellular pools of Mn in Synechocystis accurately, using inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS).
[摘要] 锰（Mn）是所有光合自养生物体必需的微量营养素。 在蓝细菌集胞藻中已经鉴定了两个不同的锰库。 PCC 6803（ Synechocystis ），其中80％的Mn存在于周质中，20％存在于细胞质和类囊体腔中（Keren等，2002）。 在这个协议中，我们描述了使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）精确定量集胞藻中周质和细胞内锰库的方法。
【背景】Mn在几种酶的活性位点中起着至关重要的作用，例如光系统II中的放氧复合物。与其作为重要的微量营养素的作用相反，锰过量时可能是有毒的。因此，蓝细菌维持细胞内的Mn水平，特别是避免游离的Mn在细胞质中是至关重要的。蓝细菌集胞藻通过在周质中储存约80％的Mn来解决这一挑战。在细胞质和类囊体系统中只能检测到20％的细胞含量（Keren等，2002），大部分Mn被掺入蛋白质中，在细胞质中几乎没有游离的Mn 。我们最近鉴定了锰转运蛋白Mnx，它存在于类囊体膜中并促进Mn从细胞质输出到集胞藻的类囊体腔中。根据我们的研究，Mnx是维持细胞Mn稳态的主要参与者（Brandenburg等人，2017）。为了分析Mnx的生物学意义，我们制定了一个方案来分别测量周质和细胞内Mn池。我们选择ICP-MS进行定量分析，因为它是检测生物样品中金属的灵敏可靠的方法。检测限可以在[ng L ...
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| DNA-free Genome Editing of Chlamydomonas reinhardtii Using CRISPR and Subsequent Mutant Analysis
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] We successfully introduced targeted knock-out of gene of interest in Chlamydomonas reinhardtii by using DNA-free CRISPR. In this protocol, the detailed procedures of an entire workflow cover from the initial target selection of CRISPR to the mutant analysis using next generation sequencing (NGS) technology. Furthermore, we introduce a web-based set of tools, named CRISPR RGEN tools (http://www.rgenome.net/), which provides all required tools from CRISPR target design to NGS data analysis.
[摘要] 我们通过使用无DNA的CRISPR成功地引入了目标克隆在赖氨酸衣藻中的目标基因敲除。在该协议中，整个工作流程的详细过程涵盖从初始目标选择CRISPR到使用下一代测序（NGS）技术的突变体分析。此外，我们介绍一种基于Web的工具集，名为CRISPR RGEN工具（ http：// www.rgenome.net/ ），其中提供了CRISPR目标设计到NGS数据分析的所有必需工具。
背景 我们最近报道（Baek等人，2016），使用预先组装的Cas9蛋白质指导RNA核糖核蛋白，模型绿色微藻（Chlamydomonas ...
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