| Electrophoretic Mobility Shift Assay of in vitro Phosphorylated RNA Polymerase II Carboxyl-terminal Domain Substrates
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Eukaryotic RNA polymerase II transcribes all protein-coding mRNAs and is highly regulated. A key mechanism directing RNA polymerase II and facilitating the co-transcriptional processing of mRNAs is the phosphorylation of its highly repetitive carboxyl-terminal domain (CTD) of its largest subunit, RPB1, at specific residues. A variety of techniques exist to identify and quantify the degree of CTD phosphorylation, including phosphorylation-specific antibodies and mass spectrometry. Electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) have been utilized since the discovery of CTD phosphorylation and continue to represent a simple, direct, and widely applicable approach for qualitatively monitoring CTD phosphorylation. We present a standardized method for EMSA analysis of recombinant GST-CTD ...
[摘要] [摘要 ] 真核RNA聚合酶II转录所有编码蛋白质的mRNA，并且受到高度调节。指导RNA聚合酶II并促进mRNA的共转录加工的关键机制是其高度重复的羧基末端结构域（CTD）的磷酸化。最大的亚基RPB1位于特定残基。存在多种鉴定和定量CTD磷酸化程度的技术，包括磷酸化特异性抗体和质谱法。自发现CTD磷酸化和本文提出了一种标准化的方法，用于EMSA分析被多种CTD激酶磷酸化的重组GST-CTD底物的EMSA方法，以及在变性/还原和还原条件下分析样品的策略。提供了半本地条件。此方法表示简单，直接，以及使用分子生物学实验室通用的设备监测重组底物中CTD磷酸化的可重现方法，该设备可轻松应用于下游分析，包括免疫印迹和质谱分析。
[背景 ] 真核生物RNA聚合酶II（RNAPII）产生所有蛋白质编码的mRNA，小核，小核仁，和许多微小RNA （杰罗尼莫等，2013;梅菲尔德。等，2016） 。各种机制中规范RNAPII活动要赋予特异性基因表达和促进生物处理工艺。在这些是直接翻译后修饰中RNAPII自己在形式的磷酸化（梅菲尔德等，2016） ，脯氨酰异构（梅菲尔德等，2015） ，甲基化（迪亚斯等人，2015年）和乙酰化（交银施罗德等，2013） 。一些研究最多的修饰是磷酸化的C端结构域RNAPII最大的亚基RPB1中（CTD） ...
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| Selective Isolation of Retroviruses from Extracellular Vesicles by Intact Virion Immunoprecipitation
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] There exists a wide variety of techniques to isolate and purify viral particles from cell culture supernatants. However, these techniques vary greatly in ease of use, purity, yield and impact on viral structural integrity. Most importantly, it is becoming evident that secreted extracellular vesicles (EVs) co-purify with retroviruses using nearly all purification methods due to nearly indistinguishable biophysical characteristics such as size, buoyant density and nucleic acid content. Recently, our group has illustrated a means of isolating intact and highly enriched retroviral virions from EV-containing cell supernatants using an immunoprecipitation approach targeting the viral envelope glycoprotein of the Moloney Murine Leukemia Virus (Renner et al., 2018). This technique, that ...
[摘要] 存在多种从细胞培养上清液中分离和纯化病毒颗粒的技术。然而，这些技术在易用性，纯度，产量和对病毒结构完整性的影响方面差异很大。最重要的是，由于几乎无法区分的生物物理特征，例如大小，浮力密度和核酸含量，使用几乎所有纯化方法分泌的细胞外囊泡（EV）与逆转录病毒共同纯化变得明显。最近，我们小组已经阐明了一种利用针对Moloney鼠白血病病毒的病毒包膜糖蛋白的免疫沉淀方法从含有EV的细胞上清液中分离完整和高度富集的逆转录病毒病毒颗粒的方法（Renner et al。， 2018）。这种技术，我们称之为完整的病毒粒子免疫沉淀（IVIP），使我们能够表征这些逆转录病毒表面上表位的可及性，并评估病毒包膜中病毒编码的整合膜蛋白Glycogag（gPr80）的方向。该方案的正确实施使得能够快速，简单且可重复地制备完整且高度纯化的逆转录病毒颗粒，其没有可检测的EV污染物。
【背景】广泛使用的分离逆转录病毒的方法，如人类免疫缺陷病毒（HIV）和小鼠白血病病毒（MLV），包括沉淀，色谱，超滤，超速离心，以及各种其他粒子分离方法（评论在Nestola et al。，2015）。虽然每种技术都有其特定的优点，缺点和局限性，但所有方法的共同关注点是细胞分泌的细胞外囊泡（EV）的共同纯化。
EV构成由所有细胞类型分泌的膜衍生囊泡的异质群体（Yanez-Mo ...
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| Tracking Endocytosis and Intracellular Trafficking of Epitope-tagged Syntaxin 3 by Antibody Feeding in Live, Polarized MDCK Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The uptake and trafficking of cell surface receptors can be monitored by a technique called ‘antibody-feeding’ which uses an externally applied antibody to label the receptor on the surface of cultured, live cells. Here, we adapt the traditional antibody-feeding experiment to polarized epithelial cells (Madin-Darby Canine Kidney) grown on permeable Transwell supports. By adding two tandem extracellular Myc epitope tags to the C-terminus of the SNARE protein syntaxin 3 (Stx3), we provided a site where an antibody could bind, allowing us to perform antibody-feeding experiments on cells with distinct apical and basolateral membranes. With this procedure, we observed the endocytosis and intracellular trafficking of Stx3. Specifically, we assessed the internalization rate of Stx3 from the ...
[摘要] 细胞表面受体的摄取和贩卖可以通过被称为“抗体 - 进纸”技术，其在外部使用上应用的抗体来标记培养的活细胞的表面上的受体进行监测。在这里，我们适应传统的抗体喂养实验极化上皮细胞（Madin-Darby犬肾）生长在透性transwell支持。通过添加两个串联胞外Myc表位标签的SNARE蛋白突触3（Stx3）的C末端，我们提供了一种站点，其中与抗体可以结合，使我们能够用不同的顶端和基底外侧膜对细胞进行抗体 - 喂养实验。通过这个程序，我们观察到Stx3的内吞和细胞内运输。具体而言，我们评估从基底外侧膜Stx3的内在化速率和在时间和空间上使用固定在不同时间点的细胞免疫荧光显微镜随后的内吞观察路径。为此，介绍了以下可追踪单层的贩运行为：来自限制膜的靶蛋白。
【背景】SNARE蛋白突触3（Stx3）是已知的建立在极化上皮细胞顶端 - 基底极性（低等人，1996年Delgrossi 等人，1997年Weimbs 等人，1997;低等人，1998;黎等人，2002;低等人
一个典型的12孔细胞培养皿的阱内的transwell小室的聚碳酸酯膜的细胞培养插入物的图1示意图。斯特朗细胞是在膜的顶部和培养将形成紧密的单层做密封关聚碳酸酯膜将顶端介质隔室与基底外侧介质隔室分开。 ...
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