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Fisher BioReagentsTM Microbiology Media: LB Agar, Miller (Powder)
Company: Fisher Scientific
Catalog#: BP1425
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Protocol for Construction of a Tunable CRISPR Interference (tCRISPRi) Strain for Escherichia coli
Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract]  We present a protocol for construction of tunable CRISPR interference (tCRISPRi) strains for Escherichia coli. The tCRISPRi system alleviates most of the known problems of plasmid-based expression methods, and can be immediately used to construct libraries of sgRNAs that can complement the Keio collection by targeting both essential and nonessential genes. Most importantly from a practical perspective, construction of tCRISPRi to target a new gene requires only one-step oligo recombineering. Additional advantages of tCRISPRi over other existing CRISPRi methods include: (1) tCRISPRi shows significantly less than 10% leaky repression; (2) tCRISPRi uses a tunable arabinose operon promoter and modifications in transporter genes to allow a wide dynamic range with graded control by ... [摘要]  我们提出了构建大肠杆菌可调CRISPR干扰（tCRISPRi）菌株的方案。 tCRISPRi系统缓解了基于质粒的表达方法的大多数已知问题，并且可以立即用于构建可通过靶向必需基因和非必需基因来补充Keio收集物的sgRNA的文库。 最重要的是从实践的角度来看，建立tCRISPRi来靶向一个新的基因只需要一步寡核苷酸重组。 tCRISPRi与其他现有CRISPRI方法的其他优点包括：（1）tCRISPRi显示低于10％的泄漏抑制; （2）tCRISPRi使用可调阿拉伯糖操纵子启动子和转运蛋白基因的修饰，以允许通过阿拉伯糖诱导剂分级控制的宽动态范围; （3）tCRISPRi是无质粒的，整个系统整合到染色体中; （4）tCRISPRi菌株显示出理想的生理特性。
【背景】已经开发了各种CRISPR干扰系统，用于从细菌到真核生物的生物体。对于正在考虑使用CRISPRi细菌的人员，我们提供了关于我们的tCRISPRi系统的以下背景资料（Li等等，2016）及其与其他CRISPRi系统的比较。
Morgan-Kiss 等人。 （2002）开发了基于质粒的剂量诱导型启动子pBAD。它们的系统允许来自pBAD启动子的蛋白质的可调节表达，取决于阿拉伯糖水平。阿拉伯糖转运蛋白基因和araFGH在菌株中是无活性的。他们的菌株也有两个拷贝的lacY ...

Isolation and Infection of Drosophila Primary Hemocytes
Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract]  Phagocytosis of invading pathogens and their subsequent clearance in lysosomes is important for organismal fitness. We have devised the following protocol to extract phagocytic hemocytes from wild-type and mutant Drosophila larvae and infect the isolated hemocytes with GFP-labeled E. coli to measure the rate of phagocytosis and degradation within individual hemocytes over time. [摘要]  入侵病原体的吞噬作用及其随后在溶酶体中的清除对于有机体适应性是重要的。我们设计了以下方案从野生型和突变型果蝇幼虫中提取吞噬性血细胞，并用GFP标记的E感染分离的血细胞。大肠杆菌以测量个体血细胞内吞噬和降解的速度。

背景 下面描述的实验可用于研究吞噬体的生物发生，成熟和向溶酶体的递送。细菌积累已经在免疫受损的果蝇的背景下得到充分的研究，其具有IMD或Toll信号传导中的缺陷，并导致抗微生物肽的表达降低（例如，Lemaitre和Hoffmann ，2007; Kleino和Silverman，2014）。细菌感染的细胞响应在果蝇中的研究较少，大多数研究集中于干扰血细胞对细菌的最初吞噬吞噬的突变（Kocks等人，2005年） ;帕森斯和福利，2016）。这种细菌摄取是直接使用FACS分析进行测量（Tirouvanziam等人，2004）。然而，对于吞噬体成熟的详细分析，我们发现检查附着在玻璃盖板上的个体血细胞是有利的（Akbar等人，2011; Rahman等人。 ，2012; Akbar等人，2016），因为这个过程为我们研究吞噬体成熟提供了时间和空间分辨率的最佳组合。

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