| Accurate, Streamlined Analysis of mRNA Translation by Sucrose Gradient Fractionation
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] The efficiency with which proteins are produced from mRNA molecules can vary widely across transcripts, cell types, and cellular states. Methods that accurately assay the translational efficiency of mRNAs are critical to gaining a mechanistic understanding of post-transcriptional gene regulation. One way to measure translational efficiency is to determine the number of ribosomes associated with an mRNA molecule, normalized to the length of the coding sequence. The primary method for this analysis of individual mRNAs is sucrose gradient fractionation, which physically separates mRNAs based on the number of bound ribosomes. Here, we describe a streamlined protocol for accurate analysis of mRNA association with ribosomes. Compared to previous protocols, our method incorporates internal ...
[摘要] 从mRNA分子产生蛋白质的效率可以在转录本，细胞类型和细胞状态之间广泛变化。准确测定mRNA翻译效率的方法对获得对转录后基因调控的机理理解至关重要。测量翻译效率的一种方法是确定与mRNA分子相关的核糖体的数目，归一化为编码序列的长度。分析单个mRNA的主要方法是蔗糖梯度分级，其基于结合核糖体的数目物理分离mRNA。在这里，我们描述了精确分析与核糖体的mRNA相关性的简化方案。与以前的方案相比，我们的方法结合内部控制和改进的缓冲条件，共同减少由非特异性mRNA - 核糖体相互作用引起的伪像。此外，我们的直接分数qRT-PCR方案消除了从梯度部分中RNA纯化的需要，这大大减少了所需的手动时间量，并促进了多个条件或基因靶标的并行分析。此外，在该过程中不产生苯酚废物。我们最初开发了协议来研究S-HAC1 mRNA的翻译抑制状态。但是我们还详细介绍了哺乳动物细胞系和组织的适应程序。
【背景】将mRNA翻译成蛋白质是一种高度调节的过程，其可以以不同的速率发生，这取决于基因，细胞环境或环境。翻译起始，延伸和终止的每个步骤可以是最终影响与mRNA相关的核糖体数量的调节点（Dever和Green，2012; ...
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| Purification of FLAG-tagged Secreted Proteins from Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] This protocol describes a method for purifying glycosylated FLAG-tagged secreted proteins with disulfide bonds from mammalian cells. The purified products can be used for various applications, such as ligand binding assays.
[摘要] 该方案描述了一种用于从哺乳动物细胞中用二硫键纯化糖基化的FLAG标记的分泌蛋白的方法。 纯化的产物可用于各种应用，例如配体结合测定。
【背景】电子。大肠杆菌是从原核生物和真核生物生产重组蛋白质的首选生物之一。细菌表达系统的主要优点是生产率高，成本低。然而，成熟蛋白质对于功能分析是必需的（例如，配体结合测定）。大多数分泌的真核蛋白通过共价聚糖键和在内质网中形成二硫键进行翻译后修饰。这些共价修饰对于分泌的成熟蛋白的一般稳定性和折叠是必需的。因此，生产哺乳动物分泌蛋白质的最佳方法是使用哺乳动物宿主来确保经过适当的翻译后修饰的重组蛋白的产生。在以下方案中，我们已经描述了从哺乳动物细胞中纯化分泌蛋白质的详细程序。该方案用于生产标记有FLAG标签的蛋白质，但也适用于其他标记（例如，His标签）蛋白质的蛋白质。
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| Flow Cytometric Analysis of HIV-1 Transcriptional Activity in Response to shRNA Knockdown in A2 and A72 J-Lat Cell Lines
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] The main obstacle to eradicating HIV-1 from patients is post-integration latency (Finzi et al., 1999). Antiretroviral treatments target only actively replicating virus, while latent infections that have low or no transcriptional activity remain untreated (Sedaghat et al., 2007). To eliminate viral reservoirs, one strategy focuses on reversing HIV-1 latency via ‘shock and kill’ (Deeks, 2012). The basis of this strategy is to overcome the molecular mechanisms of HIV-1 latency by therapeutically inducing viral gene and protein expression under antiretroviral therapy and to cause selective cell death via the lytic properties of the virus, or the immune system now recognizing the infected cells. Recently, a number of studies have described the therapeutic potential of ...
[摘要] 消除HIV-1患者的主要障碍是后整合延迟（Finzi等人，1999）。抗逆转录病毒治疗仅针对主动复制病毒，而具有低转录活性或无转录活性的潜伏感染仍未得到治疗（Sedaghat等人，2007）。为了消除病毒性水库，一项战略重点是通过“休克和杀死”来逆转HIV-1潜伏期（Deeks，2012）。该策略的基础是通过在抗逆转录病毒治疗下通过治疗性诱导病毒基因和蛋白质表达来克服HIV-1潜伏期的分子机制，并通过病毒的溶解性质或现在识别感染细胞的免疫系统引起选择性细胞死亡。最近，许多研究已经描述了药物抑制人类溴结构域蛋白质的溴结构域和末端（BET）家族的成员的治疗潜力（Filippakopoulos等人，2010; Dawson等人＆ / em>，2011; Delmore等人，2011），其包括BRD2，BRB3，BRD4和BRDT。小分子BET抑制剂，例如JQ1（Filippakopoulos et al。，2010; Delmore等人，2011），I-BET（Nicodeme等人＆lt; / ...
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