| Characterization of Protein Domain Function via in vitro DNA Shuffling
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] We recently investigated the molecular events that drive evolution of the CTX-M-type β-lactamases by DNA shuffling of fragments of the blaCTX-M-14 and blaCTX-M-15 genes. Analysis of a total of 51 hybrid enzymes showed that enzymatic activity could be maintained in most cases, yet the enzymatically active hybrids were found to possess much fewer amino acid substitutions than the few hybrids that became inactive, suggesting that point mutations in the constructs rather than reshuffling of the fragments of the two target genes would more likely cause disruption of CTX-M activity. Certain important residues that played important functional roles in mediating enzyme activity were identified. These findings suggest that DNA shuffling is an effective ...
[摘要] 我们最近研究了通过对CTX-M-14和EMX-M-14的片段进行DNA改组来驱动CTX-M型β-内酰胺酶进化的分子事件， bla CTX-M-15基因。 总共51种杂合酶的分析显示酶活性在大多数情况下可以保持，但是酶活性杂合体被发现比少数杂交体具有少得多的氨基酸取代，这表明构建体中的点突变而不是 两个靶基因片段的重新洗牌将更可能导致CTX-M活性的破坏。 确定了一些在介导酶活性中起重要作用的重要残基。 这些发现表明，DNA改组是一种有效的方法来鉴定和表征细菌蛋白质中的重要功能结构域。
【背景】DNA重组是一种自然过程，通过该过程，细菌之间交换遗传物质以增强环境压力下的生存适应性。几种杂交CTX-M-内酰胺酶（CTX-M-64，CTX-M-123，CTX-M-137和CTX-M-132）可能是由bla CTX-M-14和 bla CTX-M-15基因是世界上最常见的变异体，近年来已有报道（Nagano et al。 ，2009; Tian et al。，2014; He et al。，2015; Liu et。， 2015年）。在这些杂合酶中，包含CTX-M-15的N-和C-末端部分和CTX-M-14的中间片段的CTX-M-64显示出比其亲本原型更高的催化活性（He <等）。，2015）。
DNA改组是一种分子途径，被设计为通过PCR介导的两种靶基因的随机组合来模拟和加速进化过程（Crameri ...
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| Fluorometric Estimation of Glutathione in Cultured Microglial Cell Lysate
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Glutathione is one of the major antioxidant defense components present in cells. It is predominantly present as reduced glutathione (GSH) and converted into oxidized glutathione (GSSG) while reducing the free radicals like hydroxyl ions (OH-). For the measurement of GSH and GSSG, o-phthalaldehyde (OPT) has been used as a fluorescent reagent. O-phthalaldehyde has an ability to react specifically with GSH at pH 8 and GSSG at pH 12 respectively. N-ethylmaleimide (NEM) has been used to prevent auto-oxidation of GSH during measurement of GSSG in the present protocol. The original protocol by Hissin and Hilf was developed for glutathione estimation in Rat liver tissue. The present protocol has been standardized following Hissin and Hilf (1976) for the estimation of ...
[摘要] 谷胱甘肽是细胞中存在的主要抗氧化防御成分之一。它主要作为还原型谷胱甘肽（GSH）存在并转化为氧化型谷胱甘肽（GSSG），同时还可以减少自由基，如羟基离子（OH）。对于GSH和GSSG的测定，邻苯二甲醛（OPT）已被用作荧光试剂。邻苯二甲醛具有与pH8的GSH和pH12的GSSG特异性反应的能力。已经使用N-甲基马来酰亚胺（NEM）来在本方案中测量GSSG期间防止GSH的自动氧化。 Hissin和Hilf的原始方案被开发用于大鼠肝组织中的谷胱甘肽估计。目前的方案已经在Hissin和Hilf（1976）之后被标准化，用于估计培养的小胶质细胞裂解物中的谷胱甘肽，但它也可以用于其它哺乳动物细胞裂解物。在我们的实验中，相同的方案已被用于估计小鼠神经母细胞瘤细胞N2a的全细胞裂解物中的谷胱甘肽。
背景 该方法于1976年由Hissin和Hilf在分析生物化学方面出版（Hissin和Hilf，1976）。然而，有可用于准确检测GSH的方法;由于GSH容易氧化转化为GSSG，所以大多数方法给出过高的GSSG。 ...
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