| Expression and Purification of the Human Cation-chloride Cotransporter KCC1 from HEK293F Cells for Structural Studies
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] Cation-chloride cotransporters (CCCs) mediate the coupled, electroneutral symport of cations such as Na+ and/or K+ with chloride across membrane. Among CCCs family, K-Cl cotransporters (KCC1-KCC4) extrude intracellular Cl- by the transmembrane K+ gradient. In humans, these KCCs play vital roles in the physiology of the nervous system and kidney. However, mechanisms underlying the KCCs specific properties remain poorly understood, partly because purification of membrane proteins is challenging. Here, we present the protocol for purifying the full-length KCC1 from HEK293F cells used in our recent publication (Liu et al., 2019). The procedure may be adapted for functional and structural studies.
[摘要] [摘要]阳离子-氯化物共转运蛋白（CCC）介导诸如Na +和/或K +的阳离子与氯离子在膜上的耦合，电中性共价。间幼儿中心家庭，K-CL协同转运蛋白（KCC1-KCC4）抽UDE细胞内氯-通过跨膜ķ +梯度。在人类中，这些KCC在神经系统和肾脏的生理中起着至关重要的作用。然而，特定的KCC性质保持基本机制知之甚少，部分是因为膜蛋白的纯化是具有挑战性的。在这里，我们介绍了从我们最近的出版物中使用的HEK293F细胞中纯化全长KCC1的方案（Liu等人，2019）。该程序可适用于功能和结构研究。
[背景]人类溶质载体12（SLC12 ）基因家族编码阳离子的氯化物协同转运蛋白（CCCS）介导Cl组成的电中性同向转运-和阳离子的Na +或（和）K +跨越质膜。根据其转运特性和氨基酸序列定义，CCC可分为几个分支，包括两个Na-K-2Cl协同转运蛋白（NKCC1和NKCC2），一个Na-Cl协同转运蛋白（NCC）和四个K-Cl协同转运蛋白（KCC1-KCC4 ）。CCC在细胞体积调节，肾脏盐分重吸收和神经元GABA能调节中起重要作用。CCC的结构，生化和生物物理研究涉及在去污剂溶解状态下蛋白质生产和稳定方面的挑战。杆状病毒转导HEK293F细胞（BacMam）系统是异源表达由Eric ...
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| In vitro Enzymatic Assays of Histone Decrotonylation on Recombinant Histones
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Date:
2018-07-20
[Abstract] Class I histone deacetylases (HDACs) are efficient histone decrotonylases, broadening the enzymatic spectrum of these important (epi-)genome regulators and drug targets. Here, we describe an in vitro approach to assaying class I HDACs with different acyl-histone substrates, including crotonylated histones and expand this to examine the effect of inhibitors and estimate kinetic constants.
[摘要] I类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是有效的组蛋白去蛋白酶，拓宽了这些重要（epi-）基因组调节因子和药物靶标的酶谱。 在这里，我们描述了一种体外方法来测定具有不同酰基 - 组蛋白底物的I类HDAC，包括巴豆酰化组蛋白，并将其扩展以检查抑制剂的作用并估计动力学常数。
【背景】组蛋白的翻译后修饰是基因组调控的重要方面，包括基因表达（例如参见Pengelly et al。，2013;在Castillo 等人中综述，2017）。组蛋白修饰改变染色质结构和/或调节蛋白质的结合，例如核小体重塑因子（在Bannister和Kouzarides，2011中综述）。大多数组蛋白修饰是可逆的并且可以酶促去除。例如，通过组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）除去组蛋白乙酰化，其中存在几类。近年来，新的组蛋白赖氨酸酰化，包括琥珀酰化，丙酰化，丁酰化，羟基丁基化和巴豆酰化已成为规范组蛋白乙酰化的新替代物，并且已经证实了许多这些新发现的组蛋白修饰的功能相关性（Sabari 等人，2017）。特别是，组蛋白巴豆酰化与活性基因表达有关，并被认为受细胞代谢状态的影响（Sabari et al。，2015; Fellows et al。 ，2018年）。最近已显示I类组蛋白脱乙酰酶也有效地去除组蛋白质（Wei et al。，2017; Fellows et al。，2018）。
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| Chromatin Immunoprecipitation Experiments from Whole Drosophila Embryos or Larval Imaginal Discs
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Chromatin Immunoprecipitation coupled either to qPCR (qChIP) or high-throughput sequencing (ChIP-Seq) has been extensively used in the last decades to identify the DNA binding sites of transcription factors or the localization of various histone marks along the genome. The ChIP experiment generally includes 7 steps: collection of biological samples (A), cross-linking proteins to DNA (B), chromatin isolation and fragmentation by sonication (C), sonication test (D), immunoprecipitation with antibodies against the protein or the histone mark of interest (E), DNA recovery (E), identification of factor-associated DNA sequences by PCR or sequencing (F). The protocol described here can readily be used for ChIP-seq and ChIP-qPCR experiments. The entire procedure, describing experimental setup ...
[摘要] 与qPCR（qChIP）或高通量测序（ChIP-Seq）相结合的染色质免疫沉淀已被广泛用于识别转录因子的DNA结合位点或基因组中各种组蛋白标记的定位。 ChIP实验通常包括7个步骤：收集生物样品（A），交联蛋白质到DNA（B），染色质分离和通过超声处理分离（C），超声处理测试（D），用针对蛋白质的抗体进行免疫沉淀感兴趣的组蛋白标记（E），DNA回收（E），通过PCR或测序鉴定因子相关DNA序列（F）。这里描述的协议可以容易地用于ChIP-seq和ChIP-qPCR实验。描述在完整的果蝇组织中优化分析的实验设置条件的整个过程可以在四天内完成。
背景 尽管永生化的培养细胞广泛用于研究各种细胞类型的染色质景观，但是在生理条件下在体内探测相互作用的有价值的方法对于进行转录的时间或空间比较分析是必要的因子和组蛋白修饰图在不同阶段的果蝇发展或不同组织之间。在这里，我们提供了一个详细的ChIP协议，已被优化，以便在整个果蝇胚胎和幼虫成像光盘上工作，突出关键的实验参数。
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