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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome editing tools are used in mammalian cells to knock-out specific genes of interest to elucidate gene function. The CRISPR-Cas9 system requires that the mammalian cell expresses Cas9 endonuclease, guide RNA (gRNA) to lead the endonuclease to the gene of interest, and the PAM sequence that links the Cas9 to the gRNA. CRISPR-Cas9 genome wide libraries are used to screen the effect of each gene in the genome on the cellular phenotype of interest, in an unbiased high-throughput manner. In this protocol, we describe our method of creating a CRISPR-Cas9 genome wide library in a transformed murine macrophage cell-line (RAW264.7). We have employed this library to identify novel mediators in the caspase-11 ...
[摘要] 细菌聚集的定期交织的短回文重复（CRISPR）-Cas9基因组编辑工具用于哺乳动物细胞敲除感兴趣的特定基因以阐明基因功能。 CRISPR-Cas9系统要求哺乳动物细胞表达Cas9核酸内切酶，引导RNA（gRNA）引导内切核酸酶到目的基因，以及连接Cas9与gRNA的PAM序列。使用CRISPR-Cas9基因组宽的文库以无偏倚的高通量方式筛选基因组中每个基因对感兴趣的细胞表型的影响。在本协议中，我们描述了我们在转化的鼠巨噬细胞细胞系（RAW264.7）中创建CRISPR-Cas9基因组文库的方法。我们已经使用该文库来鉴定胱天蛋白酶-11细胞死亡途径中的新型介质（Napier等人，2016）;然而，该文库可用于筛选特定基因在多种鼠巨噬细胞通路中的重要性。
背景 历史上，使用RNA干扰（RNAi）或源自敲除小鼠的细胞，了解特定基因对真核细胞中感兴趣的表型的贡献是可能的。然而，在过去几年中，新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9已经允许在真核细胞内容易且有效地产生敲除细胞系和全基因组筛选。 CRISPR-Cas9基因组范围的筛选扩大了哺乳动物遗传学的工具箱和新型蛋白质的鉴定及其对特定表型的贡献。使用这种方法，研究人员已经能够鉴定参与肿瘤生长的新基因（Chen等人，2015; Kiessling等人，2016; Steinhart ...
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