| Ciliary Assembly/Disassembly Assay in Non-transformed Cell Lines
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The primary cilium is a non-motile sensory organelle whose assembly and disassembly are closely associated with cell cycle progression. The primary cilium is elongated from the basal body in quiescent cells and is resorbed as the cells re-enter the cell cycle. Dysregulation of ciliary dynamics has been linked with ciliopathies and other human diseases. The in vitro serum-stimulated ciliary assembly/disassembly assay has gained popularity in addressing the functions of the protein-of-interest in ciliary dynamics. Here, we describe a well-tested protocol for transfecting human retinal pigment epithelial cells (RPE-1) and performing ciliary assembly/disassembly assays on the transfected cells.
[摘要] 主要纤毛是一种非运动感觉细胞器，其装配和拆卸与细胞周期进程密切相关。 初级纤毛在静止细胞中从基体拉长并随着细胞重新进入细胞周期而被吸收。 睫状动力失调与纤毛病和其他人类疾病有关。 体外血清刺激的睫状体装配/分解测定已经在解决睫状动力学中感兴趣的蛋白质的功能方面受到欢迎。 在这里，我们描述了转染人视网膜色素上皮细胞（RPE-1）和对转染细胞进行睫状体装配/分解测定的充分测试的方案。
【背景】初级纤毛是毛发样感觉细胞器，其在G 0 / G 1期出现，并且在细胞周期的S期之前分解（Tucker等， et al。，1979）。先前的研究已经证实，某些未转化的细胞类型（即，甚至是RPE-1细胞，3T3成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞[MEFs]）可以被饿死以诱导静止和睫状体形成。随后的血清再次添加触发双相睫状体吸收，其在刺激后2小时和24小时达到峰值（Tucker等人，1979; Li等人，2011） 。该现象为文献中常用的血清刺激的睫状体组装/分解测定奠定了基础，以鉴定参与睫状体组装和拆卸的蛋白质（Pugacheva等人，2007; ...
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| Visible Immunoprecipitation (VIP) Assay: a Simple and Versatile Method for Visual Detection of Protein-protein Interactions
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] The visible immunoprecipitation (VIP) assay is a convenient alternative to conventional co-immunoprecipitation (Katoh et al., 2015). By processing lysates from cells co-expressing GFP-fusion and RFP-fusion proteins for immunoprecipitation with GST-tagged anti-GFP Nanobody and glutathione-Sepharose beads, protein-protein interactions can be visualized by directly observing the beads bearing immunoprecipitates under a fluorescence microscope. This assay can examine a large number of protein combinations at one time, without requiring time-consuming procedures, including SDS-PAGE and immunoblotting. Furthermore, the VIP assay can examine complicated one-to-many and many-to-many protein interactions. Another important point of the VIP assay is the use of nanobodies for ...
[摘要] 可见的免疫沉淀（VIP）测定是常规免疫共沉淀的方便的替代方法（Katoh等人，2015）。通过处理来自共表达GFP融合蛋白和RFP融合蛋白的细胞的裂解物以用GST标记的抗GFP纳米抗体和谷胱甘肽琼脂糖珠粒进行免疫沉淀，可以通过在荧光显微镜下直接观察带有免疫沉淀物的珠来显现蛋白质 - 蛋白质相互作用。该检测方法可以一次检测大量的蛋白质组合，无需耗时的操作，包括SDS-PAGE和免疫印迹。此外，VIP测定可以检查复杂的一对多和多对多的蛋白质相互作用。 VIP测定的另一个重要的点是使用纳米抗体进行免疫沉淀。纳米抗体是来自骆驼科（骆驼和亲戚）的单域抗体。由于其体积小，高亲和力，高特异性和稳定性，因此在E中表达的抗GFP纳米抗体。大肠杆菌可以大规模纯化，并且实际上用于免疫沉淀实验。在这里，我们描述了制备GST标记的抗GFP纳米抗体和VIP测定的方案。
【背景】细胞中的几乎所有蛋白质都通过与其他蛋白质相互作用起作用。揭示蛋白质 - 蛋白质相互作用网络是了解蛋白质功能的关键。已经开发了多种方法，例如酵母双杂交系统，GST pull-down和免疫共沉淀来分析蛋白质 - 蛋白质相互作用。最近，我们开发了一种称为可见免疫沉淀（VIP）测定的蛋白质 - 蛋白质相互作用分析的新方法（Katoh等人，2015）。 ...
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| Phagocytosis Assay of Necroptotic Cells by Cardiac Myofibroblasts
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] In myocardial infarction (MI), a plenty of cardiomyocytes undergo necrosis and necroptosis due to the lack of oxygen and nutrients. The dead cardiomyocytes are promptly engulfed by phagocytes. When the dead cells are not engulfed, the noxious contents of the cells are released outside, and thus, induce inflammation, and obstruct the function of organs. Therefore, phagocytosis is crucial for maintaining homeostasis of organs. Herein, we describe a protocol of an in vitro phagocytosis assay of necroptotic cells.
[摘要] 在心肌梗死（MI）中，由于缺氧和营养，大量心肌细胞发生坏死和坏死。 死亡心肌细胞迅速吞噬吞噬细胞。 当死细胞不被吞没时，细胞的有害物质被释放到外部，从而引起炎症，并阻碍器官的功能。 因此，吞噬对维持器官的体内平衡至关重要。 在这里，我们描述了一种神经细胞的体外吞噬作用测定方案。
【背景】以前，认为坏死性坏死细胞和坏死核细胞只能通过心脏巨噬细胞在失败的心脏中消除。 然而，我们发现负责组织纤维化的心脏肌成纤维细胞在MI后吞噬死细胞（Nakaya等，2017）。 本文中，我们提供了一种细胞凋亡细胞的体外吞噬作用的详细方案，采用在caspase-3抑制剂Z-VAD-FMK中通过TNF-α刺激进行人脑坏死的L929细胞。
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