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Author:
Date:
2021-01-05
[Abstract] All living cells use cyclic nucleotides as second messengers for signal sensing and transduction. Cyclic di-3′,5′-adenosine monophosphate (c-di-AMP) is primarily involved in the control of bacterial and euryarcheal osmoadaptation and is produced by diadenylate cyclases from two molecules of ATP. Specific phosphodiesterases hydrolyze c-di-AMP to the linear phosphoadenylate adenosine 5′-pApA or to AMP. Different methods including high-performance liquid chromatography (HPLC), thin-layer chromatography (TLC) and ion exchange chromatography (IEX) can be used to determine activities of c-di-AMP-synthesizing and degrading enzymes. Here, we describe in detail the TLC and IEX methods adapted for characterization of the diadenylate cyclase DisA and the phosphodiesterase AtaC from ...
[摘要] [摘要]所有活细胞均使用环状核苷酸作为第二信使，以进行信号传感和转导。环状二-3 ' ，5 ' -腺苷一磷酸（C-二-AMP）主要涉及细菌和控制euryarcheal osmoadaptation并且由产生diadenylate环化酶从ATP的两个分子。特定的磷酸二酯酶将c-di-AMP水解为线性磷酸腺苷腺苷5'-pApA或AMP。可以使用包括高效液相色谱（HPLC），薄层色谱（TLC）和离子交换色谱（IEX）在内的各种方法来确定c-di-AMP合成和降解酶的活性。在这里，我们详细描述了TLC和IEX方法适合于表征diadenylate环化酶DISA和磷酸二酯酶ATAC从链霉菌venezuelae 。TLC可以快速，轻松地分离放射性标记的底物和产品，而IEX避免了潜在危险的放射性底物的利用，如果没有HPLC系统，则可以用作良好的替代品。与TLC分析不同，无法使用IEX分析并行分析样品，因此更加耗时。
[背景]环核苷酸第二信使是原核和真核信号通路中的关键分子。环状二-3 ' ，5 ' -腺苷一磷酸（三二- AMP）是一种细菌第二信使与许多重要的功能，如渗压剂动态平衡调节，细胞壁代谢，生物膜的形成，DNA完整，孢子形成，毒力和生长（Fahmi et ...
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The basic unit of chromatin is the nucleosome, a histone octamer with 147 base pairs of DNA wrapped around it. Positions of nucleosomes relative to each other and to DNA elements have a strong impact on chromatin structure and gene activity and are tightly regulated at multiple levels, i.e., DNA sequence, transcription factor binding, histone modifications and variants, and chromatin remodeling enzymes (Bell et al., 2011; Hughes and Rando, 2014). Nucleosome positions in cells or isolated nuclei can be detected by partial nuclease digestion of native or cross-linked chromatin followed by ligation-mediated polymerase chain reaction (LM-PCR) (McPherson et al., 1993; Soutoglou and Talianidis, 2002). This protocol describes a nucleosome positioning assay using ...
[摘要] 染色质的基本单位是核小体，一个组织蛋白八聚体，其中包含147个碱基对的DNA。核小体相对于彼此和DNA元件的位置对染色质结构和基因活性具有强烈的影响，并且在多个水平（例如，DNA序列，转录因子结合，组蛋白修饰和变体）和染色质重塑酶（Bell et al。，2011; Hughes和Rando，2014）。可以通过天然或交联染色质的部分核酸酶消化，然后连接介导的聚合酶链反应（LM-PCR）（McPherson等人，1993; Soutoglou）检测细胞或分离的核中的核小体位置和Talianidis，2002）。该方案描述了使用微球菌核酸酶（MNase）消化甲醛固定染色质，然后进行LM-PCR的核小体定位测定。我们举例说明了在小鼠中编码核糖体RNA（rRNA基因或rDNA）的基因启动子的核小体定位测定，其具有两个相互排斥的配置。 rDNA启动子含有相对于转录起始位点的核苷酸-157至-2或位于-132位的下游核小体（NucD ）的上游核小体（NucU ）至+22（Li等人，2006; Xie等人，2012）。 LM-PCR产物的放射性标记，然后变性尿素 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳，允许两种配置的分辨和相对定量。如图1所示，核小体定位测定是通用的低至中等通量的方法，以半定量方式以高精度映射离散的核小体位置。
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