| In vitro Nitrate Reductase Activity Assay from Arabidopsis Crude Extracts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Nitrate reductase (NR) reduces the major plant nitrogen source, NO3-, into NO2-. NR activity can be measured by its final product, nitrite through its absorbance under optimized condition. Here, we present a detailed protocol for measuring relative enzyme activity of NR from Arabidopsis crude extracts. This protocol offers simple procedure and data analysis to compare NR activity of multiple samples.
[摘要] 硝酸还原酶（NR）将主要的植物氮源NO 3 N-2还原为NO 2 - 2。 NR活性可以通过其最终产物，亚硝酸盐在最佳条件下通过其吸光度来测量。 在这里，我们提供了一个详细的协议，用于测量来自拟南芥粗提物的NR的相对酶活性。 该协议提供简单的程序和数据分析来比较多个样品的NR活性。
【背景】氮是植物所需的主要营养素，主要以硝酸盐的形式吸收。硝酸还原酶是高等植物中首次同化氮的酶。植物硝酸还原酶的同型二聚体如下催化硝酸根的NAD（P）H依赖性还原为亚硝酸根：
NO <3> + NADH + H +→NO - + NAD + H 测量NR活性的方法可能是研究影响NR活性的生物因素的有力工具（Park等人，2011）。氮同化影响植物中氨基酸的含量，因此调节NR活性可用于提高某些作物的质量（Croy和Hageman，1970; Dalling和Loyn，1977; Ruan等人，1998） ）。在该协议中，在优化的缓冲液条件下限制时间内亚硝酸盐浓度增加作为可比值获得。亚硫酸盐浓度通过Griess测定法通过其在540nm处的吸光度来测量。简言之，亚硝酸盐与磺胺酸形成重氮盐，然后N-（1-萘基）乙二胺二盐酸盐形成有色偶氮化合物。可以比较这些值以确定样品如何具有不同的NR活性。此外，通过简单的过程可以将这些数值转换为精确增加的亚硝酸盐浓度。 ...
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| Uptake Assays to Monitor Anthracyclines Entry into Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Anthracyclines, such as doxorubicin and daunorubicin, are DNA damaging agents that autofluoresce and can be readily detected in cells. Herein, we developed suitable assays to quantify and localize daunorubicin in mammalian cells. These assays can be exploited to identify components that are involved in the uptake of anthracyclines.
[摘要] 蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，是DNA损伤剂，其可自发荧光并且可以容易地在细胞中检测到。 在这里，我们开发了合适的测定法来定量和定位哺乳动物细胞中的柔红霉素。 可以利用这些测定来鉴定参与蒽环类药物吸收的成分。
【背景】蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，通过损伤DNA起作用，用于治疗各种类型的癌症，包括急性骨髓性白血病。当癌症患者被系统地给予蒽环类抗生素时，有几个因素限制了到达肿瘤部位的药物的量（Chauncey，2001; Deng等，2014; Riganti等，2015）。在肿瘤中，对癌细胞的药物活性受到药物吸收不良，药物流出过量以及细胞靶标变化的限制。几十年来，这些DNA损伤剂如何进入癌细胞还不清楚（Aouida等，2010; Cesar-Razquin等，2015; Zhang等，2015）。为了解决这个问题，我们开发了三种可靠的体外测定法来监测柔红霉素在细胞中的积累。这些测定中的两个是定量的，需要获得荧光活化细胞分选（FACS）口径和Fluoroskan仪器，第三个是使用落射荧光显微镜进行半定量。使用这些测定法，我们确定柔红霉素以时间和浓度依赖的方式进入细胞，并且每种细胞类型显示不同的摄取速率，这表明活性过程参与蒽环类药物的摄入（Andreev等人， ...
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| Imaging the Pharynx to Measure the Uptake of Doxorubicin in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] Caenorhabditis elegans offers an array of advantages to investigate the roles of uptake transporters. Herein, an epifluorescent microscopy approach was developed to monitor the uptake of the autofluorescent anticancer drug, doxorubicin, into the pharynx of C. elegans by organic cation transporters.
[摘要] 秀丽隐杆线虫提供了一系列优势来调查摄取转运蛋白的作用。在这里，开发了荧光显微镜方法来监测自发荧光抗癌药物多柔比星进入C的咽部。有机阳离子转运蛋白。
背景 人类细胞具有超过450个溶质载体转运蛋白，其被认为有助于摄取几种离子，营养物质以及治疗和抗癌药物（Cesar-Razquin等人，2015）。然而，大量这些摄取转运蛋白的作用和底物是未知的。线虫是一种廉价的模型生物体，它比哺乳动物细胞提供了许多优点，可以快速研究许多高度保守的生物过程。在过去十年中，这种生物一直在几个药物发现计划中发挥作用，以鉴定新型小分子，例如，作为抗微生物剂和抑制氧化应激的小分子，尽管生物活性化合物的产量不太明显（Burns等人，2010; O'Reilly等人，，2014）。我们认为如果通过摄取转运蛋白进入动物细胞的分子更多和选择性地流入，则回收率可能更高。迄今为止，已经进行了三项研究以了解摄取转运蛋白在C中的作用。 elegans （Wu et al。，1999; Cheah等人，2013; Papaluca和Ramotar，2016）。因此，该生物体中摄取转运蛋白的功能和底物特异性的表征将有利于改进用于鉴定新生物活性分子的策略。在这里，我们概述了一种监测抗癌药物多柔比星摄入到C的咽中的方法。 elegans （Papaluca和Ramotar，2016）。多柔比星自发荧光可以通过几种广泛可用的检测系统如荧光显微镜来监测。我们注意到，从这种方法可以获得若干好处，包括通过竞争多柔比星摄取来寻找转运蛋白的新型治疗底物。 ...
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