| Hypoxia Reporter Element Assay
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Hypoxia is a condition in which there is a decrease in oxygen supply to the cellular environment. Changes to cellular oxygen levels can lead to transcriptional changes of oxygen-regulated genes. Reporter assays are used to study gene expression alteration and modifications in response to environmental changes. Dual-reporter assays allow the simultaneous measurement of two different genes within a single cell, thus improving experimental accuracy. Within this protocol, we describe the utilization of the LightSwitch Dual Assay System to measure BMX expression in response to hypoxic conditions.
[摘要] 缺氧是细胞环境中氧供应减少的一种情况。 细胞氧水平的变化可导致氧调节基因的转录变化。 报告分析用于研究响应环境变化的基因表达改变和修饰。 双报告分析允许同时测量单个细胞内的两个不同基因，从而提高实验准确性。 在该协议中，我们描述了LightSwitch双重测定系统的使用，以测量响应缺氧条件的BMX表达。
【背景】在我们最近的出版物（van Oosterwijk et al。，2018）中，我们试图检测BMX（一种非受体酪氨酸激酶）对索拉非尼治疗的反应。 BMX是一种Tec激酶家族成员，已知与酪氨酸磷酸化蛋白结合并通过与磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸结合而介导膜靶向（PIP3; Chen 等人，2013）。我们发现索拉非尼在有或没有基质细胞支持的急性髓性白血病（AML）细胞系中的直接治疗对BMX的上调没有贡献。以前的研究表明缺血可诱导BMX表达，索拉非尼具有抗血管生成活性（He et al。，2006; Davis et al。，2011）。因此，我们假设索拉非尼的抗血管生成活性导致骨髓内的缺氧环境，从而导致AML中缺氧依赖性BMX上调。在缺氧条件下，我们能够显示许多不同细胞系中BMX表达的显着增加。 BMX启动子的进一步分析在-5005处鉴定出推定的缺氧反应元件（HRE; ...
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| Assaying the Effects of Splice Site Variants by Exon Trapping in a Mammalian Cell Line
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] There are several in silico programs that endeavor to predict the functional impact of an individual’s sequence variation at splice donor/acceptor sites, but experimental confirmation is problematic without a source of RNA from the individual that carries the variant. With the aid of an exon trapping vector, such as pSPL3, an investigator can test whether a splice site sequence change leads to altered RNA splicing, through expression of reference and variant mini-genes in mammalian cells and analysis of the resultant RNA products.
[摘要] 有几个计算机程序尝试预测个体在剪接供体/受体位点的序列变异的功能影响，但实验确认是有问题的，没有携带变体的个体的RNA来源。借助于外显子捕获载体，例如pSPL3，研究人员可以通过在哺乳动物细胞中表达参考和变体小基因来测试剪接位点序列变化是否导致改变的RNA剪接，并分析所得RNA产物。
背景 我们希望通过实验测试在TEK基因中鉴定的两个剪接供体位点变体c.760 + 2T> C和c.3300 + 2delT的功能影响（Souma等人，2016）。通常情况下，携带这些序列变体的个体不能获得细胞或mRNA的样品，因此我们利用外显子捕获方法作为功能测试。来自患者的DNA样品可用于感兴趣的基因组区域的PCR扩增。如果患者gDNA样品不可用，也可以通过诸如基于PCR的定点诱变等方法将序列变体并入野生型序列。
＆NBSP;外显子捕获方法最初是为了鉴定长期基因组DNA中的未知外显子而开发的（Duyk等人，1990）。创建了pSPL3外显子捕获载体以提高外显子鉴定的效率和可靠性，并且还允许筛选更大的基因组片段（Church et al。，1994; Nisson等，1994）。 pSPL3载体含有由SV40启动子组成的小型人造基因，具有功能性剪接供体和受体位点的外显子 - 内含子 - ...
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