| Quantitative Irreversible Tethering (qIT) for Target-directed Covalent Fragment Screening
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Small molecules that react to form covalent bonds with proteins are widely used as biological tools and therapeutic agents. Screening cysteine-reactive fragments against a protein target is an efficient way to identify chemical starting points for covalent probe development. Mass spectrometry is often used to identify the site and degree of covalent fragment binding. However, robust hit identification requires characterization of the kinetics of covalent binding that can be readily achieved using quantitative irreversible tethering. This screening platform uses a non-specific cysteine-reactive fluorogenic probe to monitor the rate of reaction between covalent fragments and cysteine containing biomolecules. Fragment libraries are simultaneously screened against the target protein and ...
[摘要] [摘要]与蛋白质反应形成共价键的小分子被广泛用作生物学工具和治疗剂。筛选针对蛋白质靶标的半胱氨酸反应性片段是鉴定共价探针开发的化学起点的有效方法。质谱通常用于鉴定共价片段结合的位点和程度。然而，强大的命中鉴定需要的共价结合的动力学表征是 使用定量不可逆的网络共享可以轻松实现。该筛选平台使用非特异性的半胱氨酸反应性荧光探针来监测共价片段与含半胱氨酸的生物分子之间的反应速率。同时针对目标蛋白和作为对照的谷胱甘肽筛选片段文库，以鉴定具有动力学选择性的命中片段，以对目标进行共价修饰。通过定量不可逆的束缚进行筛选，可以解释单个片段内在反应性的变化，从而实现可靠的命中鉴定和排名。
[背景]位点定向配体发现最早在2000报道，并利用表面暴露半胱氨酸残基共价陷阱二硫键连接的片段，其结合在相邻的口袋（Erlanson等人，2000 ）。从那时起，不可逆的半胱氨酸靶向抑制剂已广泛普及，现在已成为多种肿瘤学适应症的一线治疗方法，其中值得注意的例子是针对BTK和EGFR以及以前不可药物治疗的靶标，例如KRAS（G12C）。随着这些发展，基于共价片段的配体发现已成为设计靶标特异性共价抑制剂的有效途径（Resnick et al。，2019 ...
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| Biochemical Pulldown of mRNAs and Long Noncoding RNAs from Cellular Lysates Coupled with Mass Spectrometry to Identify Protein Binding Partners
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Author:
Date:
2020-06-05
[Abstract] RNA binding proteins (RBPs) interact with cellular mRNAs, controlling various steps throughout the lifetime of these transcripts, including transcription, cellular transport, subcellular localization, translation and degradation. In addition to binding mRNA transcripts, a growing number of RBPs are shown to bind long noncoding RNAs (lncRNAs), controlling key cellular processes, including gene expression and translation of proteins. Current methodologies aimed at identifying and characterizing protein binding partners of specific RNAs of interest typically rely on tagging of the RNA with affinity aptamers, using in vitro transcribed RNA or immobilized oligonucleotides to capture RNA-protein complexes under native conditions. These assays are coupled with mass spectrometry or ...
[摘要] [摘要] RNA结合蛋白（限制性商业惯例）我Nteract随着细胞mRNA，控制整个这些转录，包括转录，细胞运输，亚细胞定位，翻译和降解。除了寿命结合mRNA转录物，越来越多的各种步骤的限制性商业惯例被证明与长期的非编码RNA（lncRNA ）结合，控制关键的细胞进程，包括基因的表达和蛋白质的翻译。目前旨在鉴定和表征感兴趣的特定RNA的蛋白质结合伴侣的方法主要依靠用亲和适体标记RNA。 ，使用体外转录的RNA或固定的寡核苷酸在天然条件下捕获RNA-蛋白质复合物，这些测定方法与质谱或Western Blot分析相结合，以鉴定或/和确认相互作用的蛋白质。 mRNA和大的长非编码RNA的伴侣。oach依赖于特定靶RNA的生化下拉以及细胞裂解液中相互作用的蛋白伴侣与质谱的结合来鉴定新的相互作用蛋白。通过使用与靶RNA杂交的24-48〜20 mer 生物素化DNA 探针，该方法可确保高特异性和最小限度的脱靶结合。这种方法具有可重现性和快速性，可作为发现研究以鉴定与目标RNA结合的蛋白质的基础。
[背景] RNA结合蛋白（RBP）与细胞中的mRNA相互作用形成核糖核蛋白（RNP）复合物，通过影响转录物的加工，亚细胞定位，翻译和稳定性来调节这些转录物的转录后活性（综述见Lunde 等人。，2007; Glisovic ...
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| CRISPR-mediated Tagging with BirA Allows Proximity Labeling in Toxoplasma gondii
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Defining protein interaction networks can provide key insights into how protein complexes govern complex biological problems. Here we define a method for proximity based labeling using permissive biotin ligase to define protein networks in the intracellular parasite Toxoplasma gondii. When combined with CRISPR/Cas9 based tagging, this method provides a robust approach to defining protein networks. This approach detects interaction within intact cells, it is applicable to both soluble and insoluble components, including large proteins complexes that interact with the cytoskeleton and unique microtubule organizing center that comprises the apical complex in apicomplexan parasites.
[摘要] 定义蛋白质相互作用网络可以为蛋白质复合物如何控制复杂的生物学问题提供关键信息 在这里我们定义了一种基于接近度的标记方法，使用宽容的生物素连接酶来定义细胞内寄生虫弓形虫的蛋白质网络。 当与基于CRISPR / Cas9的标记结合使用时，这种方法提供了一种可靠的方法来定义蛋白质网络。 这种方法检测完整细胞内的相互作用，它适用于可溶性和不可溶性成分，包括与细胞骨架相互作用的大型蛋白质复合物和独特的微管组织中心，其中包括顶尖复合体在顶尖复合寄生虫中。
【背景】分析蛋白质 - 蛋白质相互作用是解决蛋白质如何组装和作为大分子复合物的关键努力。传统上，通过免疫共沉淀（共-IP）和随后的质谱分析已经鉴定出蛋白质复合物。然而，一些蛋白质复合物取代基可能在co-IP的裂解，下拉和洗涤步骤期间人为失去或获得，这对于不溶性膜或需要侵蚀性溶解的结构蛋白质尤其成问题。作为co-IP的替代物，邻近依赖性生物素鉴定（BioID）提供了在正常细胞稳态期间紧邻目标靶蛋白的蛋白质“快照”（Roux等人，2012年）。 BioID利用融合到感兴趣的靶蛋白的混杂的大肠杆菌生物素蛋白连接酶（BirA）。生物素补充使得BirA融合物在30纳米内允许生物素化的近邻生物体（Roux et al。，2012; Van Itallie et al。，2013） ...
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