| Cell-free Reconstitution of the Packaging of Cargo Proteins into Vesicles at the trans Golgi Network
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Protein sorting at the trans Golgi network (TGN) plays important roles in targeting newly synthesized proteins to their specific destinations. The aim of this proposal is to reconstitute the packaging of non-Golgi resident cargo proteins into vesicles at the TGN, utilizing rat liver cytosol, semi-intact mammalian cells and nucleotides. The protocol describes how to perform the vesicle formation assay, how to isolate vesicles and how to detect cargo proteins in vesicles. This reconstitution assay can be used to quantitatively measure the efficiency of the packaging of a specific cargo protein into transport vesicles at the TGN under specific experimental conditions.
[摘要] [摘要] 反式高尔基体网络（TGN）上的蛋白质分选在将新合成的蛋白质靶向其特定目的地方面起着重要作用。该提议的目的是利用大鼠肝细胞溶质，半完整的哺乳动物细胞和核苷酸，在TGN处将非高尔基驻留的货物蛋白重新包装成囊泡。该协议描述了如何进行囊泡形成测定，如何分离囊泡以及如何检测囊泡中的货物蛋白。该重构测定法可用于定量测量在特定实验条件下将特定货物蛋白包装到TGN的运输小泡中的效率。
[背景] 的反式高尔基体网络（TGN）是在分泌运送路径的必要的交通枢纽。为了确保水泡运输的保真度，真核细胞利用各种蛋白质分选设备将特定的货物蛋白质准确地包装到TGN的运输小泡中，然后运至特定的目的地（Guo 等人，2014）。为了加深我们对TGN分选过程特异性的理解，重要的是开发一种能够忠实地重构TGN囊泡形成和货物分选过程的分析方法。该测定法可用于直接和定量地测量特定因子在调节特定货物蛋白包装到运输小泡中的作用。从内质网（ER）将货物蛋白包装到COPII囊泡中的无细胞重构已得到很好的建立（Kim 等，2005; Kim 等，2007; Merte 等，2010; Yuan 等。，2018；Niu 等，2019；）。已经开发出一种体外测定法，其在TGN处重构特定货物蛋白TGN46在运输小泡中的释放（Ponnambalam 等，1996；Wakana ...
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| Phos-tag Immunoblot Analysis for Detecting IRF5 Phosphorylation
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] While the activation of the transcription factor interferon regulatory factor 5 (IRF5) is critical for the induction of innate immune responses, it also contributes to the pathogenesis of the autoimmune disease systemic lupus erythematosus (SLE). IRF5 phosphorylation is a hallmark of its activation in the Toll-like receptor (TLR) pathway, where active IRF5 induces type I interferon and proinflammatory cytokine genes. By using the phosphate-binding molecule Phos-tag, without either radioisotopes or phospho-specific antibodies, the protocol described here enables detection of the phosphorylation of both human and murine IRF5, as well as that of other proteins.
[摘要] 虽然转录因子干扰素调节因子5（IRF5）的激活对于诱导先天免疫应答至关重要，但也有助于自身免疫疾病系统性红斑狼疮（SLE）的发病机制。 IRF5磷酸化是其在Toll样受体（TLR）途径中的活化的标志，其中活性IRF5诱导I型干扰素和促炎细胞因子基因。通过使用不含放射性同位素或磷酸特异性抗体的磷酸结合分子磷酸标签，本文所述的方案可以检测人和鼠IRF5以及其他蛋白质的磷酸化。
背景 在TLR-MyD88途径中，IRF5通过翻译后修饰如泛素化和磷酸化被激活，然后活性IRF5转位到细胞核中并诱导其靶基因（Takaoka等人，2005; Balkhi ，2008; Tamura等人，2008; Hayden and Ghosh，2014）。关于IRF5在SLE中的激活状态，已经报道了IRF5积累在SLE患者的单核细胞核中（Stone等人，2012）。此外，我们最近在SLE鼠模型中显示，IRF5超激活（例如，升高的磷酸化）导致SLE样疾病的发展（Ban 等人，，2016年）。因此，分析IRF5的激活状态对于研究SLE以及先天免疫应答是重要的。磷酸化是IRF5激活的核心，因为许多研究已经通过定点诱变和/或质谱法揭示了IRF5的功能性磷酸化位点（Barnes等人，2002; Lin et al。等人，2005; ...
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