| Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC is an ideal method to study protein-protein interactions in myofibrils. Here we present a protocol for generating transgenic flies compatible with BiFC and a method for analyzing protein-protein ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补（BiFC ）是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号，从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中，附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里，我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议，以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白，只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位，并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸（Reedy和Beall，1993）。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分：细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线，而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此，Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要，而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型（Lemke和Schnorrer，2017年）。
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| Transfer of Large Contiguous DNA Fragments onto a Low Copy Plasmid or into the Bacterial Chromosome
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] Bacterial pathogenicity islands and other contiguous operons can be difficult to clone using conventional methods due to their large size. Here we describe a robust 3-step method to transfer large defined fragments of DNA from virulence plasmids or cosmids onto smaller autonomously replicating plasmids or directly into defined sites in the bacterial chromosome that incorporates endogenous yeast and λ Red homologous recombination systems. This methodology has been successfully used to isolate and integrate at least 31 kb of contiguous DNA and can be readily adapted for the recombineering of E. coli and its close relatives.
[摘要] 由于其大尺寸，细菌致病性岛和其它连续操纵子可能难以使用常规方法克隆。在这里我们描述了一个强大的3步法从毒力质粒或粘粒转移大型定义的片段到更小的自主复制质粒或直接到细胞染色体，并入内源性酵母和λ红色同源重组系统的定义网站。该方法已经成功地用于分离和整合至少31kb的连续DNA，并且可以容易地适应于E的重组。大肠杆菌及其近亲。
[背景] 分离和繁殖大片DNA的能力大大扩展了基因网络和操纵子的研究。然而，用于该目的的传统使用的工程质粒，例如细菌人工染色体（BAC），虽然极其有用，但是受到DNA稳定性，拷贝数和复杂装配要求的问题的限制。或者，将构建体直接并入细菌染色体中通过减少由于存在多个基因拷贝引起的基因表达的变化以及确保基因的稳定维持而提供了优点，同时还避免了对抗生素选择的需要。这里描述的方法最初被设计为捕获和转移编码Shigella flexneri 3型分泌系统的31kb DNA操纵子到大肠杆菌染色体上（Reeves ...
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| Target Gene Inactivation in Cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120
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Author:
Date:
2016-08-05
[Abstract] Anabaena sp. strain PCC 7120 has long served as a model organism for investigating N2-fixation, photosynthesis, and various plant-type metabolic pathways and biofuel production, as well as cellular differentiation (Xu et al., 2008, Halfmann et al., 2014, Golden and Yoon, 2003). Since more than 30,000 sequenced bacterial genomes are currently available (Land et al., 2015), specific gene inactivation and analyses of the corresponding mutant’s phenotype have become powerful tools in elucidating the function of a target gene. Here we describe a protocol to inactivate a target gene in Anabaena sp. PCC 7120 using a single-crossover approach. This approach requires only one-step cloning of an internal fragment of a target gene into an ...
[摘要] 菌株PCC 7120长期充当用于研究N 2 - 固定，光合作用和各种植物类型代谢途径和生物燃料生产以及细胞分化的模式生物体（Xu等人，/em>。，2008，Halfmann等人，2014，Golden and Yoon，2003）。由于目前可获得超过30,000个测序的细菌基因组（Land等人，2015），特异性基因失活和相应突变体表型的分析已成为阐明靶基因功能的有力工具。在这里，我们描述了灭活anabaena sp中的靶基因的方案。 PCC 7120使用单交叉方法。该方法仅需要将靶基因的内部片段一步克隆到整合载体中以产生货物质粒。在货物质粒和鱼腥藻染色体之间的单次交换（同源重组）时，内源靶基因通过产生3'-和5'-缺失的片段而被破坏。该基因失活方案基于整合载体pZR606（Chen等人，2015），其可以广泛应用于其他蓝细菌物种以及其他原核生物中的基因失活。
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