| HIVGKO: A Tool to Assess HIV-1 Latency Reversal Agents in Human Primary CD4+ T Cells
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Author:
Date:
2018-10-20
[Abstract] While able to suppress HIV replication in HIV infected individuals, combination antiretroviral therapy (ART) fails to eliminate viral latent reservoir, which consists in integrated transcriptional silenced HIV provirus. So far, identification of latently-infected cells has relied on activating cells to induce expression of HIV proteins which can then be detected. Unfortunately, this activation significantly changed the cell phenotype. We developed a novel HIV reporter, named HIVGKO, that allows the purification of latently-infected cells in absence of reactivation. Indeed, latent cells can be identified by expression of the EF1a-driven mKO2 and lack of expression of the LTR-driven csGFP. This protocol can be used to study the effectiveness of LRAs (Latency Reversal Agents) in ...
[摘要] 虽然能够抑制HIV感染个体中的HIV复制，但联合抗逆转录病毒疗法（ART）无法消除病毒潜伏性储库，其包含整合的转录沉默的HIV原病毒。 到目前为止，潜伏感染细胞的鉴定依赖于激活细胞以诱导HIV蛋白的表达，然后可以检测到这些蛋白的表达。 不幸的是，这种激活显着改变了细胞表型。 我们开发了一种名为HIV GKO 的新型HIV报告基因，可以在没有再激活的情况下纯化潜伏感染的细胞。 实际上，可以通过EF1a驱动的mKO2的表达和LTR驱动的csGFP的缺乏表达来鉴定潜伏细胞。 该方案可用于研究LCA（潜伏期逆转剂）在原代细胞中重新激活潜伏HIV的有效性。
【背景】新版双标记病毒（HIV GKO ）含有5'LTR中HIV-1启动子控制下的密码子转换eGFP（csGFP）和一种独特的无关荧光蛋白 mKO2在细胞延伸因子αα启动子（EF1α）的控制下。 当使用与遗传相关的荧光蛋白时，由于重组问题，在这些报道分子中使用不相关的荧光蛋白是很重要的。 因此，生产性感染的细胞主要是csGFP + mKO2 + （有些可能只是GFP + ），而潜伏感染的细胞是csGFP - mKO2 + 。 流式细胞仪如分拣机AriaII允许纯化纯感染人群（生产性，潜伏性和/或未感染），而分析仪LSRII允许评估HIV GKO LTR的转录激活。 感染后的时间很短。
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| Multicolor Stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy to Generate High-resolution Images of Respiratory Syncytial Virus Particles and Infected Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Human respiratory syncytial virus (RSV) infection in human lung epithelial A549 cells induces filopodia, cellular protrusions consisting of F-actin, that extend to neighboring uninfected cells (Mehedi et al., 2016). High-resolution imaging via stimulated emission depletion (STED) microscopy revealed filamentous RSV particles along these filopodia, suggesting that filopodia facilitate RSV cell-to-cell spread (Mehedi et al., 2016). In this protocol, we describe how to fix, permeabilize, immunostain, and mount RSV-infected A549 cells for STED imaging. We show that STED increases resolution compared to confocal microscopy, which can be further improved by image processing using deconvolution software.
[摘要] 人肺上皮A549细胞中的呼吸道合胞病毒（RSV）感染诱导丝状伪足，由F-肌动蛋白组成的细胞突起，延伸至相邻的未感染细胞（Mehedi等，2016）。 通过受激发射耗尽（STED）显微镜的高分辨率成像显示沿着这些丝状伪足的丝状RSV颗粒，表明丝状伪足有助于RSV细胞对细胞的扩散（Mehedi等，2016）。 在本协议中，我们描述如何修复，渗透，免疫染色和挂载RSV感染的A549细胞进行STED成像。 我们显示与共聚焦显微镜相比，STED增加了分辨率，可以通过使用去卷积软件的图像处理进一步改进。
【背景】RSV形成多形性病毒颗粒，其长度大约为直径约100nm，长度大约为10μm（Bachi和Howe，1973; Mehedi等，2016）。高分辨率光学显微技术是可视化RSV感染细胞和病毒颗粒之间相互作用的关键。在最近的一项研究中，我们使用超分辨率荧光显微镜来研究人肺上皮A549细胞中的RSV细胞对细胞的扩散。
STED显微镜是超分辨率显微镜技术之一，已被开发以规避约200nm衍射屏障的光限制（Hell和Wichmann，1994; Westphal等人，2008）。 ...
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| Adhesion and Invasion Assay Procedure Using Caco-2 Cells for Listeria monocytogenes
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Listeria monocytogenes is an important Gram-positive foodborne pathogen that is a particular problem in ready-to-eat food. It has an ability to survive in harsh conditions like refrigeration temperatures and high salt concentrations and is known to cross intestinal, placental and blood-brain barriers. Several cancerous cell lines like cervical, liver, dendritic, intestinal and macrophages have been used to study in vitro propagation and survival of listeria in human cells. Human intestinal epithelial cells have been used to study how listeria crosses the intestinal barrier and cause infection. The protocol in this articles describes the procedures to grow Caco-2 cells, maintain cells and use them for adhesion and invasion assays. During adhesion assay the cells are ...
[摘要] 单核细胞增生利斯特氏菌是一种重要的革兰氏阳性食源性病原体，是即食食品中的一个特殊问题。它具有在诸如制冷温度和高盐浓度的恶劣条件下生存的能力，并且已知可以穿过肠，胎盘和血脑屏障。已经使用了诸如子宫颈，肝脏，树突状细胞，肠和巨噬细胞的几种癌细胞系来研究人细胞中李斯特菌的体外扩增和存活。人肠上皮细胞已被用于研究李斯特菌如何穿过肠屏障并引起感染。本文中的方案描述了生长Caco-2细胞的过程，维持细胞并将其用于粘附和侵袭测定。在粘附测定期间，将细胞与李斯特菌孵育30分钟，但是在侵袭测定中，细胞生长在感染后的几个时间点被停止以监测细胞中李斯特菌的生长和存活率。
背景 ...
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