| Primary Culture System for Germ Cells from Caenorhabditis elegans Tumorous Germline Mutants
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The Caenorhabditis elegans germ line is an important model system for the study of germ stem cells. Wild-type C. elegans germ cells are syncytial and therefore cannot be isolated in in vitro cultures. In contrast, the germ cells from tumorous mutants can be fully cellularized and isolated intact from the mutant animals. Here we describe a detailed protocol for the isolation of germ cells from tumorous mutants that allows the germ cells to be maintained for extended periods in an in vitro primary culture. This protocol has been adapted from Chaudhari et al., 2016.
[摘要] 秀丽隐杆线虫种系是胚芽干细胞研究的重要模型系统。 野生型C。 线虫生殖细胞是合胞体，因此不能在体外培养中分离。 相比之下，来自肿瘤突变体的生殖细胞可以完全被细胞化并从突变动物中完整分离。 在这里，我们描述了从肿瘤突变体中分离生殖细胞的详细方案，其允许生殖细胞在体外原代培养中长时间维持。 该协议已从2016年Chaudhari等人改编。
【背景】秀丽生殖细胞在位于两个性腺臂的远端区域的两个成体干细胞龛中产生（Hansen和Schedl，2013; Kimble和Seidel，2013）。在野生型雌雄同体中，有丝分裂生殖细胞仅限于性腺臂的远端，干细胞生态位。野生型生殖细胞是合胞体，并且包含延伸通过性腺臂中心区域的共同细胞质的开口。 ℃。线虫肿瘤种系突变体在整个性腺中增加了生殖细胞的有丝分裂增殖。我们发现肿瘤种系突变体通常具有完整的细胞生殖细胞，其含有完整的质膜（Chaudhari等人，2016）。这种细胞化允许生殖细胞的分离及其在培养中的维持。该方案描述了分离和维持培养物中肿瘤突变体的生殖细胞的方法学和组织培养基。虽然已经描述了用于C的主要培养物的培养基。 elegans 胚胎和幼虫细胞（Strange等人，2007; Zhang和Kuhn，2013），生殖细胞在这种培养基中不能存活（Chaudhari等人。 ...
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| Digestion of Peptidoglycan and Analysis of Soluble Fragments
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Peptidoglycan (murein) is a vital component of the cell wall of nearly all bacteria, composed of sugars linked by short peptides. This protocol describes the purification of macromolecular peptidoglycan from cultured bacteria and the analysis of enzyme-digested peptidoglycan fragments using high performance liquid chromatography (HPLC). Digested peptidoglycan fragments can be identified by mass spectrometry, or predicted by comparing retention times with other published chromatograms. The quantitative nature of this method allows for the measurement of changes to peptidoglycan composition between different species of bacteria, growth conditions, or mutations. This method can determine the overall architecture of peptidoglycan, such as peptide stem length, the extent of cross-linking, and ...
[摘要] 肽聚糖（murein）是由短肽连接的糖组成的几乎所有细菌的细胞壁的重要组成部分。 该方案描述了从培养细菌中纯化大分子肽聚糖和使用高效液相色谱（HPLC）分析酶消化的肽聚糖片段。 消化的肽聚糖片段可以通过质谱鉴定，或通过比较保留时间与其他公开的色谱图预测。 该方法的定量性质允许测量不同种类的细菌，生长条件或突变之间肽聚糖组成的变化。 该方法可以确定肽聚糖的总体结构，如肽长度，交联程度和修饰。 已经使用神经肽分析来研究肽聚糖相关蛋白的功能和细菌获得抗生素抗性的机制。
【背景】肽聚糖由通过肽干连接在一起的糖骨架组成，其产生对细胞形状重要的网状结构和细菌细胞的膨胀压力。大分子肽聚糖从在细胞质中合成的单体单元组装，并由具有5个氨基酸的茎组成的具有5个氨基酸的葡萄糖胺和N-乙酰氨基葡萄糖二糖组成。当单体翻转到周质中时，通过反式糖基化将其加入到聚糖链中，并且通过转肽酶将一部分肽茎连接在一起。
＆NBSP;包含肽干的氨基酸可以根据物种变化，但通常以L-丙氨酸，D-谷氨酸，内消旋二氨基庚二酸，D-丙氨酸，D-丙氨酸，丙氨酸，在一些革兰氏阳性中，L-赖氨酸代替二氨基庚二酸。通过直接或通过连接氨基酸连接第三或第四氨基酸的第三个氨基酸的游离胺进行交联（Schleifer和Kandler，1972）。其他常见的修饰包括氨基酸的酰胺化（Kato和Strominger，1968）和O-乙酰化（Clarke和Dupont，1992）或者N-脱乙酰化（Araki ...
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| Assay to Measure Interactions between Purified Drp1 and Synthetic Liposomes
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] A mitochondrion is a dynamic intracellular organelle that actively divides and fuses to control its size, number and shape in cells. A regulated balance between mitochondrial division and fusion is fundamental to the function, distribution and turnover of mitochondria (Roy et al., 2015). Mitochondrial division is mediated by dynamin-related protein 1 (Drp1), a mechano-chemical GTPase that constricts mitochondrial membranes (Tamura et al., 2011). Mitochondrial membrane lipids such as phosphatidic acid and cardiolipin bind Drp1, and Drp1-phospholipid interactions provide key regulatory mechanisms for mitochondrial division (Montessuit et al., 2010; Bustillo-Zabalbeitia et al., 2014; Macdonald et al., 2014; Stepanyants et al., 2015; ...
[摘要] 线粒体是一种动态的细胞内细胞器，主动分裂和融合以控制细胞的大小，数量和形状。线粒体分裂和融合之间的调节平衡是线粒体功能，分布和周转的基础（Roy等，2015）。线粒体分化是由动力蛋白相关蛋白1（Drp1）介导的，其是限制线粒体膜的机械化学GTP酶（Tamura等人，2011）。线粒体膜脂质如磷脂酸和心磷脂结合Drp1，并且Drp1磷脂相互作用提供线粒体分裂的关键调控机制（Montessuit等人，2010; Bustillo-Zabalbeitia等人2014年; Macdonald等人，2014年; Stepanyants等人，2015; Adachi等人，2016）。在这里，我们描述了使用纯化的重组Drp1和具有定义的一组磷脂的合成脂质体定量测量Drp1与脂质的相互作用的生物化学实验。该测定使得可以定义蛋白质 - 脂质相互作用的特异性以及头基和酰基链的作用。
背景 蛋白质和膜脂质的相互作用对于细胞如细胞器分裂中生物膜的重塑至关重要。在线粒体分裂中，Drp1限制线粒体膜并驱动该膜重塑过程。我们最近显示，信号磷脂，磷脂酸与Drp1相互作用，并通过限制线粒体上的组装分裂机制（Adachi等人，2016）产生启动步骤。 Drp1识别磷脂酸的头基和酰基链。为了分析Drp1-磷脂酸结合，我们建立了几种蛋白质 - ...
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