| Alphavirus Purification Using Low-speed Spin Centrifugation
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Chemical and sedimentation procedures are used to purify virus particles. While these approaches are successful for wild-type viruses, they are often not feasible for purifying mutant viruses with assembly defects. We combined two published methods (Atasheva et al., 2013; Moller-Tank et al., 2013), to generate a protocol that uses low-speed centrifugation to purify both wildtype and mutant enveloped virus particles at high yield with minimal handling steps. This protocol has successfully been used to purify alphavirus particles for imaging and structural studies (Wang et al., 2015; Ramsey et al., 2017).
[摘要] 化学和沉淀过程用于纯化病毒颗粒。 虽然这些方法对于野生型病毒是成功的，但它们通常不能用于纯化具有装配缺陷的突变病毒。 我们结合了两种公开的方法（Atasheva等人，2013; Moller-Tank等人，2013），以生成使用低速离心纯化两种方法的方案 野生型和突变体包膜病毒颗粒，产量高，处理步骤最少。 该方案已成功用于纯化甲病毒颗粒用于成像和结构研究（Wang等人，2015; Ramsey等人，2017）。
【背景】传统上，病毒纯化基于化学沉淀（例如PEG）或密度梯度离心。离心方案包括以高速（>100,000μgx g）或通过沉淀基质如铯，Nycodenz，碘克沙醇，蔗糖，甘油或酒石酸丸粒化颗粒。在梯度沉降之后，纯化的病毒样品通常需要额外的步骤来除去梯度基质，浓缩纯化的颗粒，并且缓冲液交换成用于下游应用的稳定缓冲液。这些方法包括透析，通过离心过滤器离心或PEG沉淀。虽然这些方法会产生纯化的颗粒，但有几个缺点：（1）总产量可能很低，（2）纯化所需的时间可能延长到一周，（3）形态上不均匀的颗粒不能以相同的效率纯化，（ 4）过程中可能会损坏颗粒，以及（5）组装突变体常常不能在净化过程中存活，使得某些下游分析具有挑战性。
这里描述的协议使用温和的方法来净化包膜病毒颗粒。我们使用最小的离心力来减少对粒子的损伤，这是由于负染透射电子显微镜（TEM）中增加的形态异质性或通过TEM或传染性测定法测定的易碎粒子的全部损失而观察到的。另外，我们希望减少纯化后纯化病毒体的操作。通过合并文献中的两个方案（Atasheva等人，2013; ...
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| An Improved Method for Measuring Chromatin-binding Dynamics Using Time-dependent Formaldehyde Crosslinking
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Formaldehyde crosslinking is widely used in combination with chromatin immunoprecipitation (ChIP) to measure the locations along DNA and relative levels of transcription factor (TF)-DNA interactions in vivo. However, the measurements that are typically made do not provide unambiguous information about the dynamic properties of these interactions. We have developed a method to estimate binding kinetic parameters from time-dependent formaldehyde crosslinking data, called crosslinking kinetics (CLK) analysis. Cultures of yeast cells are crosslinked with formaldehyde for various periods of time, yielding the relative ChIP signal at particular loci. We fit the data using the mass-action CLK model to extract kinetic parameters of the TF-chromatin interaction, including the on- and ...
[摘要] 甲醛交联广泛用于与染色质免疫沉淀（ChIP）相结合来测量沿着DNA的相对位置以及转录因子（TF）-DNA相互作用的体内相对水平。但是，通常所做的测量不能提供关于这些交互的动态属性的明确信息。我们已经开发了一种方法来评估来自时间依赖性甲醛交联数据的结合动力学参数，称为交联动力学（CLK）分析。酵母细胞的培养物与甲醛交联不同的时间段，在特定位点产生相对的ChIP信号。我们使用质量作用CLK模型来拟合数据，以提取TF-染色质相互作用的动力学参数，包括开关速率和交联速率。从停车费和停车费中我们可以获得停车和停车时间。以下方案是该方法的第二次迭代，CLKv2，更新了改进的交联和淬火条件，更多关于交联速率的信息以及对观察到的动力学模型建模的系统程序。已应用CLKv2分析来研究TATA结合蛋白（TBP）和其他TF的选定子集的结合行为。该协议使用酵母细胞开发，但也可适用于来自其他生物体的细胞。
【背景】转录起始是一个复杂的过程，涉及染色质化启动子上数十种蛋白的协作和协调相互作用（Kim等人，2005; Encode Consortium，2012; Rhee等人， ，2012; Dowen等人，2014年）。许多研究已经研究了体外核心转录机器的组装和调控（Zawel和Reinberg，1992; Conaway和Conaway，1993; Roeder，1996; ...
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| Tracking Endocytosis and Intracellular Trafficking of Epitope-tagged Syntaxin 3 by Antibody Feeding in Live, Polarized MDCK Cells
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The uptake and trafficking of cell surface receptors can be monitored by a technique called ‘antibody-feeding’ which uses an externally applied antibody to label the receptor on the surface of cultured, live cells. Here, we adapt the traditional antibody-feeding experiment to polarized epithelial cells (Madin-Darby Canine Kidney) grown on permeable Transwell supports. By adding two tandem extracellular Myc epitope tags to the C-terminus of the SNARE protein syntaxin 3 (Stx3), we provided a site where an antibody could bind, allowing us to perform antibody-feeding experiments on cells with distinct apical and basolateral membranes. With this procedure, we observed the endocytosis and intracellular trafficking of Stx3. Specifically, we assessed the internalization rate of Stx3 from the ...
[摘要] 细胞表面受体的摄取和贩卖可以通过被称为“抗体 - 进纸”技术，其在外部使用上应用的抗体来标记培养的活细胞的表面上的受体进行监测。在这里，我们适应传统的抗体喂养实验极化上皮细胞（Madin-Darby犬肾）生长在透性transwell支持。通过添加两个串联胞外Myc表位标签的SNARE蛋白突触3（Stx3）的C末端，我们提供了一种站点，其中与抗体可以结合，使我们能够用不同的顶端和基底外侧膜对细胞进行抗体 - 喂养实验。通过这个程序，我们观察到Stx3的内吞和细胞内运输。具体而言，我们评估从基底外侧膜Stx3的内在化速率和在时间和空间上使用固定在不同时间点的细胞免疫荧光显微镜随后的内吞观察路径。为此，介绍了以下可追踪单层的贩运行为：来自限制膜的靶蛋白。
【背景】SNARE蛋白突触3（Stx3）是已知的建立在极化上皮细胞顶端 - 基底极性（低等人，1996年Delgrossi 等人，1997年Weimbs 等人，1997;低等人，1998;黎等人，2002;低等人
一个典型的12孔细胞培养皿的阱内的transwell小室的聚碳酸酯膜的细胞培养插入物的图1示意图。斯特朗细胞是在膜的顶部和培养将形成紧密的单层做密封关聚碳酸酯膜将顶端介质隔室与基底外侧介质隔室分开。 ...
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