| Separation of Thylakoid Protein Complexes with Two-dimensional Native-PAGE
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] The hierarchical composition and interactions of the labile thylakoid protein complexes can be assessed by sequential 2D-native gel-electrophoresis system. Mild non-ionic detergent digitonin is used to solubilize labile protein super-and megacomplexes, which are then separated with first-dimension blue native polyacrylamide gel electrophoresis (1D-BN-PAGE). The digitonin derived protein complexes are further solubilized with stronger detergent, β-DM, and subsequently separated on an orthogonal 2D-BN-PAGE to release smaller protein subcomplexes from the higher-order supercomplexes. Here we describe a detailed method for 2D-BN-PAGE analysis of thylakoid protein complexes from Arabidopsis thaliana.
[摘要] 不稳定的类囊体蛋白复合物的分级组成和相互作用可以通过连续的2D天然凝胶电泳系统来评估。 温和的非离子洗涤剂洋地黄皂苷用于溶解不稳定的蛋白质超级和巨型复合物，然后用第一维蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-BN-PAGE）分离。 将洋地黄皂苷衍生的蛋白质复合物用更强的去污剂β-DM进一步溶解，随后在正交的2D-BN-PAGE上分离，以从较高级的超复合物中释放较小的蛋白质亚复合物。 在这里，我们描述了来自拟南芥的类囊体蛋白复合物的2D-BN-PAGE分析的详细方法。
【背景】在类囊体膜中发生光合作用的光反应，在高等植物中，由贴壁的grana类囊体和非贴壁的基质类囊体组成。光反应由多亚基蛋白复合物光系统（PS）I和II，细胞色素b 6 f和ATP酶催化。 PSII及其光捕获天线复合物（LHCII）在grana-thylakoids中最为丰富，因此在空间上与基质类囊体定位的PSI-LHCI复合物隔离（Andersson和Anderson，1980）。格拉纳和基质类囊体之间的间期在两个光系统中都得到了丰富（Albertsson，2001; Suorsa et al。，2015）。通过光依赖性LHCII和PSII蛋白的可逆磷酸化介导，光系统与LHCII一起组装成更大的超级和超级复合物。 ...
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| Mating Based Split-ubiquitin Assay for Detection of Protein Interactions
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The mating based split-ubiquitin (mbSUS) assay is an alternative method to the classical yeast two-hybrid system with a number of advantages. The mbSUS assay relies on the ubiquitin-degradation pathway as a sensor for protein-protein interactions, and it is suitable for the determination of interactions between full-length proteins that are cytosolic or membrane-bound. Here we describe the mbSUS assay protocol which has been used for detecting the interaction between K+ channel and SNARE proteins (Grefen et al., 2010 and 2015; Zhang et al., 2015 and 2016)
[摘要] 基于交配的分ubiquitin（mbSUS）测定是具有许多优点的经典酵母双杂交系统的替代方法。 mbSUS测定依赖于泛素降解途径作为蛋白质 - 蛋白质相互作用的传感器，并且它适用于测定细胞溶质或膜结合的全长蛋白质之间的相互作用。在这里，我们描述了已经用于检测K + 通道和SNARE蛋白之间的相互作用的mbSUS测定方案（Grefen等人，2010和2015; Zhang 等等，2015和2016）
背景 图1是mbSUS测定的概况。泛素部分被分成两半，N末端半突变（NubG）以避免重组。泛素部分（Cub）的C末端一半与转录报告基因复合物PLV（Protein A-LexA-VP16）连接。两种蛋白质（X和Y）分别与NubG和CubPLV融合产生蛋白质 - 蛋白质相互作用分析系统。转化后，酵母菌株THY.AP5含有NubG-X融合蛋白，而酵母菌株THY.AP4含有Y-CubPLV融合蛋白。在交配后，在二倍体酵母中，如果蛋白质X和Y彼此相互作用，则将重新组装功能性泛素，这导致PLV的切割。释放的转录蛋白复合物PLV可以开启报告基因（ADE2，HIS3），并允许酵母生长在选择性培养基上。
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