| Dual Fluorescence Reporter Based Analytical Flow Cytometry for miRNA Induced Regulation in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] MicroRNA-induced gene regulation is a growing field in basic and translational research. Examining this regulation directly in cells is necessary to validate high-throughput data originated from RNA sequencing technologies. For this several studies employ luciferase-based reporters that usually measure the whole cell population, which comes with low resolution for the complexity of the miRNA-induced regulation. Here, we provide a protocol using a dual-fluorescence reporter and flow cytometry reaching single cell resolution; the protocol contains a simplified workflow that includes: vector generation, data acquisition, processing, and analysis using the R environment. Our protocol enables high-resolution measurements of miRNA induced post-transcriptional gene regulation and combined with ...
[摘要] MicroRNA诱导的基因调控是基础和转化研究中不断增长的领域。 直接在细胞中检查该调节对于验证源自RNA测序技术的高通量数据是必要的。 对于这一研究，一些研究采用基于荧光素酶的报告基因，通常测量全细胞群，其具有低分辨率的miRNA诱导调节的复杂性。 在这里，我们提供使用双荧光报告基因和流式细胞仪达到单细胞分辨率的方案; 该协议包含一个简化的工作流程，包括：使用R环境进行矢量生成，数据采集，处理和分析。 我们的协议可实现miRNA诱导的转录后基因调控的高分辨率测量，并结合系统生物学，可用于估计miRNA的熟练程度。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是高度保守的小型非蛋白质编码RNA（21-22nt），可调节转录后基因表达并调节基因生物学过程，如发育和细胞稳态（Lagos-Quintana et al。，2001; Fabian et al。，2010; Bartel，2018），包括miRNA表达与肿瘤进展和侵袭性相关的几种病理（Lu et al。， 2005; Di Leva和Croce，2013; Krishnan et al。，2015; Bertoli et ...
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| Immunoprecipitation of Cell Surface Proteins from Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The meningococcus (Neisseria meningitidis) remains an important threat to human health worldwide. This Gram-negative bacterium causes elevated disabilities and mortality in infected individuals. Despite several available vaccines, currently there is no universal vaccine against all circulating meningococcal strains (Vogel et al., 2013). Herein, we describe a new protocol that is capable of identifying only cell surface exposed proteins that play a role in immunity, providing this research field with a more straightforward approach to identify novel vaccine targets. Even though N. meningitidis is used as a model in the protocol herein described, this protocol can be used for any Gram-negative bacteria provided modifications and optimizations are carried out to ...
[摘要] 脑膜炎球菌（脑膜炎奈瑟氏球菌）仍然是全球人类健康的重大威胁。这种革兰氏阴性细菌导致感染个体的残疾和死亡率升高。尽管有几种可用的疫苗，目前还没有针对所有循环脑膜炎球菌菌株的通用疫苗（Vogel等人，2013）。在这里，我们描述了一种能够识别仅在细胞表面暴露的蛋白质在免疫中发挥作用的新方案，为该研究领域提供了一种更直接的方法来鉴定新的疫苗靶标。即使使用脑膜炎奈瑟氏球菌作为本文所述方案中的模型，该方案可用于任何革兰氏阴性细菌，提供修饰和优化以使其适应不同的细菌和疾病特征（例如薄膜脆性，生长方法，血清抗体水平，等等）。
背景 尝试开发针对N型的新型疫苗。脑膜炎脑膜炎常常依赖于2D SDS-PAGE（二维十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳）和蛋白质印迹，随后MS（质谱）（Wheeler等人，2007））。然而，这种方法采用全细胞裂解物，鉴定出不具有疫苗潜力的大量蛋白质（Mendum等人，2009）。因此，我们旨在开发一种能够鉴别可能在免疫中起重要作用的细胞表面暴露蛋白质的方法。简言之，我们的方案包括生长感兴趣的病原体，用免疫个体的血清免疫沉淀表面抗原，并通过液相色谱 - ...
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