Method for CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Candida albicans
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Candida albicans is the most prevalent and important human fungal pathogen. The advent of CRISPR as a means of gene editing has greatly facilitated genetic analysis in C. albicans. Here, we describe a detailed step-by-step procedure to construct and analyze C. albicans deletion mutants. This protocol uses plasmids that allow simple ligation of synthetic duplex 23mer guide oligodeoxynucleotides for high copy gRNA expression in C. albicans strains that express codon-optimized Cas9. This protocol allows isolation and characterization of deletion strains within nine days.
[摘要] 白色念珠菌是最普遍和最重要的人类真菌病原体。 CRISPR作为基因编辑手段的出现极大地促进了 C中的遗传分析。白色假丝酵母。 在这里,我们描述一个详细的分步过程来构建和分析 C。 白色念珠菌缺失突变体。 该协议使用质粒,允许合成的双链体23mer引导寡聚脱氧核苷酸在高拷贝gRNA表达的简单连接。 表达密码子优化的Cas9的白色念珠菌菌株。 该协议允许在9天内分离和鉴定缺失菌株。
【背景】℃。白色念珠菌是一种难以处理遗传的有机体。由于它通常作为不容易进行有性生殖的二倍体存在,所以纯合隐性突变需要对每个基因座进行连续修饰。克隆间规则间隔短回文重复(CRISPR)突变的发展和应用。白色念珠菌促进遗传操作,因为它允许两个等位基因同时突变(Vyas et al。,2015; Min et al。,2016; Ng and Dean,2017 )。 CRISPR基因编辑涉及将RNA引导的核酸酶募集至邻近NGG原型间隔子邻接基序(PAM)的互补靶位点(Jinek等人,2012; Cong等人, 2013年;马里等人,2013年)。 CRISPR相关(Cas)核酸酶通过与结合Cas9的激活CRISPR RNA(tracrRNA)相关的指导RNA之间的互补碱基配对以高特异性进行靶向(Gasiunas等人, ...
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Construction of a Single Transcriptional Unit for Expression of Cas9 and Single-guide RNAs for Genome Editing in Plants
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-associated protein9 (Cas9) is a simple and efficient tool for genome editing in many organisms including plant and crop species. The sgRNAs of the CRISPR/Cas9 system are typically expressed from RNA polymerase III promoters, such as U6 and U3. In many transformation events, more nucleotides will increase the difficulties in plasmid construction and the risk of wrong integration in genome such as base-pair or fragment missing (Gheysen et al., 1990). And also, in many organisms, Pol III promoters have not been well characterized, and heterologous Pol III promoters often perform poorly (Sun et al., 2015). Thus, we have developed a method using single transcriptional unit (STU) CRISPR-Cas9 system to drive ...
[摘要] 相关蛋白9(Cas9)的CRISPR(聚集的定期交织的短回文重复序列)是许多生物体(包括植物和作物物种)中基因组编辑的简单有效的工具。 CRISPR / Cas9系统的sgRNA通常由RNA聚合酶III启动子(如U6和U3)表达。 在许多转化事件中,更多的核苷酸将增加质粒构建中的困难和基因组错误整合的风险,如碱基对或片段缺失(Gheysen等,1990)。 而且,在许多生物体中,Pol III启动子没有得到很好的表征,异源Pol III启动子通常表现不佳(Sun等,2015)。 因此,我们开发了使用单转录单位(STU)CRISPR-Cas9系统来驱动来自单个RNA聚合酶II启动子的Cas9和sgRNA的表达以在植物中实现有效的基因组编辑的方法。 【背景】CRISPR-Cas9系统的sgRNA主要由小核RNA启动子如U6和U3促进。虽然在许多情况下已经进行了繁殖效率的测试,但也有一些局限性:(1)难以实现Cas9和sgRNA的协调和/或诱导表达; (2)操作多个sgRNA用于多重基因编辑可能是乏味的,需要多个Pol III启动子。传统的RNA聚合酶II启动子不能用于驱动sgRNA表达,通过RNA聚合酶II将多余的核苷酸加入到gRNA的5'和3'末端,并可能中断正常的gRNA功能。另外,由RNA聚合酶II转录的RNA被快速输出到细胞质中,而CRISPR-Cas9 / ...
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CRISPR/Cas9 Editing of the Bacillus subtilis Genome
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] A fundamental procedure for most modern biologists is the genetic manipulation of the organism under study. Although many different methods for editing bacterial genomes have been used in laboratories for decades, the adaptation of CRISPR/Cas9 technology to bacterial genetics has allowed researchers to manipulate bacterial genomes with unparalleled facility. CRISPR/Cas9 has allowed for genome edits to be more precise, while also increasing the efficiency of transferring mutations into a variety of genetic backgrounds. As a result, the advantages are realized in tractable organisms and organisms that have been refractory to genetic manipulation. Here, we describe our method for editing the genome of the bacterium Bacillus subtilis. Our method is highly efficient, resulting in ...
[摘要] 大多数现代生物学家的基本过程是研究生物体的遗传操作。尽管许多不同的方法用于编辑细菌基因组已经在实验室中使用了数十年,但CRISPR / Cas9技术对细菌遗传学的适应使得研究人员能够以无与伦比的设施来操纵细菌基因组。 CRISPR / Cas9允许基因组编辑更精确,同时也提高将突变转移到各种遗传背景的效率。因此,在遗传操作难以处理的易处理生物和生物体中实现了这些优点。在这里,我们描述了我们编辑枯草芽孢杆菌细菌基因组的方法。我们的方法是高效的,导致精确,无标记的突变。此外,在产生编辑质粒之后,可以将突变快速导入几个遗传背景,大大增加可进行遗传分析的速度。
枯草芽孢杆菌是高度易处理的革兰氏阳性菌。遗传研究适用于使用多种载体通过同源重组快速有效地引入突变。尽管有许多不同的方法来引入B突变。 subtilis,每种方法都有其局限性。一种简单而简单的方法,用于在B中进行突变。枯草芽孢杆菌是基因破坏,其中将质粒整合到感兴趣的基因内(Vagner等人,1998)。主要的局限性包括:1)扰乱操纵子的极地作用的潜力; 2)引进和保留外来DNA; 3)一旦使用抗生素耐药性盒,如果在其他突变的背景下研究给定的突变,则研究者必须使用不同的盒;和4)该方法限于靶向整个基因,并且不能产生更精确的点突变。 ...
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