| Boron Uptake Assay in Xenopus laevis Oocytes
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Boron (B) is essential for plant growth and taken up by plant roots as boric acid. Under B limitation, B uptake and translocation in plants are dependent on the boric acid channels located in the plasma membrane. Xenopus leavis oocyte is a reliable heterologous expression system to characterize transport activities of boric acid channels and related major intrinsic proteins (aquaporins). Here, we outline the protocols for expression of boric acid channels and boric acid uptake assay in Xenopus leavis oocytes.
[摘要] 硼（B）对植物生长至关重要，并被植物根部吸收为硼酸。 在B限制下，植物中的B吸收和转运依赖于位于质膜中的硼酸通道。 非洲爪蟾卵母细胞是一种可靠的异源表达系统，用于表征硼酸通道和相关主要内在蛋白（水通道蛋白）的运输活性。 在这里，我们概述了在非洲爪蟾卵母细胞中表达硼酸通道和硼酸摄取测定的方案。
【背景】硼对植物生长是必不可少的，但是它在积累时是有毒的。硼通过鼠李糖聚半乳糖醛酸II区果胶多糖的交联在细胞壁中具有结构功能（Funakawa和Miwa，2015）。在溶液中，B主要以生理pH下的硼酸形式存在[B（OH）3 H 2 O 2 B（OH）4] + - （p k a = 9.24）]。硼酸是一种小的中性分子，因此在生物膜上显示出显着的被动扩散（Dordas等人，2000）。此外，植物利用属于主要内在蛋白质（MIP，水通道蛋白）家族的硼酸通道和硼酸盐出口者（BOR家族）来维持B体内平衡（Takano等人，2008）。
最初，玉米PIP1在非洲爪蟾卵母细胞中表达并且显示出促进硼酸摄入比注水卵母细胞高30％（Dordas et al。 2000>）。然后，显示拟南芥NIP5; 1促进硼酸摄取比注水卵母细胞高5至9倍（Takano等人，2006）。与发现缺乏NIP5; ...
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| Affinity Purification of the RNA Degradation Complex, the Exosome, from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The following protocol describes an approach to purify RNA exosome complexes from HEK-293 cells, making use of inducible ectopic expression, affinity capture, and rate-zonal centrifugation. The obtained RNA exosomes have been used successfully for proteomic, structural, and enzymatic studies (Domanski et al., 2016).
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。以下方案描述了从HEK-293细胞中纯化RNA外来体复合物的方法，利用可诱导的异位表达，亲和力捕获和速率 - 区带离心。所获得的RNA外来体已被成功地用于蛋白质组学，结构和酶学研究（Domanski等人，2016）。
在我们以前的工作中，我们建立了在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo Fisher）的控制下表达C末端3xFLAG标记的外来体组分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / em>。，2012）。进一步探索使用的蛋白质提取条件，我们开发了一种允许在亲和捕获的外来体内保留DIS3（RRP44）的方案，否则证明是困难的（Hakhverdyan等人，2015）。基于这些研究，我们通过使用甘油密度梯度的速率区带离心法进一步纯化了RNA外来体（+/- DIS3）（Domanski等人，2016）。虽然蛋白质提取物中洗涤剂CHAPS（3 - ...
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