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Date:
2017-04-20
[Abstract] Fluorescence live-cell imaging by single molecule localization microscopy (SMLM) or fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in principle allows for the spatio-temporal observation of molecular patterns in individual, living cells. However, the dynamics of molecules within cells hamper their precise observation. We present here a detailed protocol for consecutive cycles of reversible cryo-arrest of living cells on a microscope that allows for a precise determination of the evolution of molecular patterns within individual living cells. The usefulness of this approach has been demonstrated by observing ligand-induced clustering of receptor tyrosine kinases as well as their activity patterns by SMLM and FLIM (Masip et al., 2016).
[摘要] 通过单分子定位显微镜（SMLM）或荧光寿命成像显微镜（FLIM）的荧光活细胞成像原理上允许在个体，活细胞中的分子模式的时空观察。然而，细胞内分子的动力学阻碍了它们的精确观察。我们在这里介绍一个详细的方案，用于显微镜上活细胞可逆冷冻停滞的连续循环，允许精确测定各个活细胞内分子模式的演变。通过观察受体酪氨酸激酶的配体诱导的聚集以及SMLM和FLIM的活性模式已经证明了该方法的有用性（Masip等人，2016）。
了解细胞中的分子过程，例如受体 - 酪氨酸激酶（RTK）的配体诱导反应需要精确的时空观察分子模式。由于细胞状态的差异，这种反应需要在个体细胞而不是细胞群体中进行监测（Snijder和Pelkmans，2011）。使用SMLM，各个分子可以以高精度进行定位（Betzig等人，2006）。这允许例如提取关于质膜中的RTK聚类的信息。互补地，共焦FLIM可以揭示分子如何在衍射受限体积元素内作为整体反应。这可以通过使用构象传感器揭示RTK与下游分子的相互作用模式，磷酸化模式以及活性模式（Offterdinger等人，2004; Sabet等人）。 ...
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