| Analysis of Exosome Transfer in Mammalian Cells by Fluorescence Recovery after Photobleaching
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] During the course of evolution, prokaryote and eukaryote cells have developed elegant and to some extent analogous strategies to communicate with each other and to adapt to their surrounding environment. Eukaryotic cells communicate with each other through direct interaction via juxtracrine signaling and/or by secreting soluble factors. These secreted factors can subsequently act on the cell itself (autocrine signaling) or interact with neighboring (paracrine signaling) and distant (endocrine signaling) cells. The transmission of signals between cells and tissues has been traditionally thought to be regulated by a protein-based signaling system. Typically, proteins destined for secretion into the extracellular milieu by exocytosis contain a canonical secretion-targeting sequence (Théry et ...
[摘要] 在进化过程中，原核生物和真核生物细胞已经形成了优雅，在一定程度上类似的相互交流和适应周围环境的策略。真核生物细胞通过直接相互作用经Juxtracrine信号传导和/或通过分泌可溶性因子相互沟通。这些分泌的因子随后可以作用于细胞本身（自分泌信号传导）或与邻近的（旁分泌信号传导）和远处的（内分泌信号传导）细胞相互作用。传统上认为细胞和组织之间的信号传递受到基于蛋白质的信号传导系统的调节。通常，通过胞吐作用分泌到细胞外环境中的蛋白质含有典型的分泌靶向序列（Théry等，2002）。然而，具有非连续和刺激依赖性分泌的蛋白质，不含有经典分泌靶向序列的蛋白质，以及在细胞外环境（DNA，mRNA，肽，代谢物，miRNA和其他RNA）中可能过于不稳定的物质物种）可以以特定的方式分泌在小膜胞外囊泡（EV）中（Hagiwara等人，2014）。外来体代表直径为30-130nm的这些分泌的膜囊泡中的一大类（Cocucci等人，2009;Théry等人，2009; Kowal等人， >，et al。，2014），其形成在称为多泡体的内体隔室中的分泌细胞内。加载到外泌体中的分子以及细胞之间外来体转移的强度是随后调节受体细胞的重要参数。目前关于外泌体分泌及其在受体细胞中内化的知识仍不完整。已知外泌体的分泌强度根据细胞类型和其生理状态而变化（Garcia等人，2016）。此外，促进与细胞 - ...
|
|
|
| Reversible Cryo-arrests of Living Cells to Pause Molecular Movements for High-resolution Imaging
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Fluorescence live-cell imaging by single molecule localization microscopy (SMLM) or fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in principle allows for the spatio-temporal observation of molecular patterns in individual, living cells. However, the dynamics of molecules within cells hamper their precise observation. We present here a detailed protocol for consecutive cycles of reversible cryo-arrest of living cells on a microscope that allows for a precise determination of the evolution of molecular patterns within individual living cells. The usefulness of this approach has been demonstrated by observing ligand-induced clustering of receptor tyrosine kinases as well as their activity patterns by SMLM and FLIM (Masip et al., 2016).
[摘要] 通过单分子定位显微镜（SMLM）或荧光寿命成像显微镜（FLIM）的荧光活细胞成像原理上允许在个体，活细胞中的分子模式的时空观察。然而，细胞内分子的动力学阻碍了它们的精确观察。我们在这里介绍一个详细的方案，用于显微镜上活细胞可逆冷冻停滞的连续循环，允许精确测定各个活细胞内分子模式的演变。通过观察受体酪氨酸激酶的配体诱导的聚集以及SMLM和FLIM的活性模式已经证明了该方法的有用性（Masip等人，2016）。
了解细胞中的分子过程，例如受体 - 酪氨酸激酶（RTK）的配体诱导反应需要精确的时空观察分子模式。由于细胞状态的差异，这种反应需要在个体细胞而不是细胞群体中进行监测（Snijder和Pelkmans，2011）。使用SMLM，各个分子可以以高精度进行定位（Betzig等人，2006）。这允许例如提取关于质膜中的RTK聚类的信息。互补地，共焦FLIM可以揭示分子如何在衍射受限体积元素内作为整体反应。这可以通过使用构象传感器揭示RTK与下游分子的相互作用模式，磷酸化模式以及活性模式（Offterdinger等人，2004; Sabet等人）。 ...
|
|
|
| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
|
|
Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
|
|
|