| Preparation of Yeast tRNA Sample for NMR Spectroscopy
|
|
Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Transfer RNAs (tRNAs) are heavily decorated with post-transcriptional modifications during their biosynthesis. To fulfil their functions within cells, tRNAs undergo a tightly controlled biogenesis process leading to the formation of mature tRNAs. In addition, functions of tRNAs are often modulated by their modifications. Although the biological importance of post-transcriptional RNA modifications is widely appreciated, methods to directly detect their introduction during RNA biosynthesis are rare and do not easily provide information on the temporal nature of events. To obtain information on the tRNA maturation process, we have developed a methodology, using NMR as a tool to monitor tRNA maturation in a non-disruptive and continuous fashion in cellular extracts. By following the ...
[摘要] [摘要 ] 转移RNA（tRNA ）在其生物合成过程中大量修饰有转录后修饰。为了在细胞内履行其功能，tRNA 经历了严格控制的生物生成过程，导致了成熟的tRNA 的形成。此外，tRNA的功能通常是虽然转录后修饰RNA的生物学重要性被广泛理解，方法直接检测它们的RNA生物合成过程中引入是罕见的，并且不容易提供上events.To的时间特性信息获取的信息的tRNA 成熟 在此过程中，我们开发了一种方法，使用NMR作为监测细胞提取物中tRNA 成熟的无中断和连续方式。通过模型酵母tRNA 的时间分辨NMR 成熟，我们发现修饰是该方法的实施需要对具有不同修饰状态的tRNA 样品进行NMR光谱学分析，以鉴定各个修饰的NMR特征。此处将介绍用于NMR光谱分析修饰途径的tRNA 样品的生产，并在酵母tRNA Phe 上进行例证，但可以通过更改构建体的序列扩展到其他tRNA 。该方案描述了未修饰的生产通过体外转录获得tRNA 样品，并通过在大肠杆菌中重组表达tRNA 产生修饰的tRNA 样品。大肠杆菌。
[背景 ] 在生活的各个领域，合成和RNA的成熟包括在特定地点的核苷酸的转录后的化学修饰。在不同的RNA家族，tRNA基因不仅显示最高多种化学修饰，而且密度最高每转录修饰（〜中经修饰的核苷酸8-25％的tRNA 各种生物体的）（Boccaletto ...
|
|
|
| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
|
|
Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
|
|
|
| Expression, Purification and Crystallisation of the Adenosine A2A Receptor Bound to an Engineered Mini G Protein
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] G protein-coupled receptors (GPCRs) promote cytoplasmic signalling by activating heterotrimeric G proteins in response to extracellular stimuli such as light, hormones and nucleosides. Structure determination of GPCR–G protein complexes is central to understanding the precise mechanism of signal transduction. However, these complexes are challenging targets for structural studies due to their conformationally dynamic and inherently transient nature. We recently developed an engineered G protein, mini-Gs, which addressed these problems and allowed the formation of a stable GPCR–G protein complex. Mini-Gs facilitated the structure determination of the human adenosine A2A receptor (A2AR) in its G protein-bound conformation at 3.4 Å resolution. ...
[摘要] G蛋白偶联受体（GPCR）通过激活异源三聚体G蛋白来响应细胞外刺激如光，激素和核苷来促进细胞质信号传导。 GPCR-G蛋白复合物的结构测定对于了解信号转导的精确机制至关重要。然而，由于它们的构象动态和固有的短暂性质，这些复合物是结构研究的具有挑战性的目标。我们最近开发了一种工程化的G蛋白，微型G ，解决了这些问题，并允许形成稳定的GPCR-G蛋白复合物。 Mini-G 促进了人腺苷A 2A受体（A 2A 2A）在其G蛋白结合构象中的结构测定，在3.4 Å分辨率。在这里，我们描述了A 2A R R的表达和纯化的一步一步的方案，并且A 2AA-R-mini-G'子>复杂。
背景 我们最近开发了一种工程化的最小G蛋白，迷你G（Carpenter和Tate，2016），其促进了人腺苷A 2A受体的结构测定（A <其活性状态（carpenter等人，2016）。 mini-g="">充分稳定A 2A R的活性构象，以允许络合物在洗涤剂辛硫基葡糖苷中通过蒸气扩散结晶。在这里，我们描述了一种用于表达和纯化Aβ2A ...
|
|
|