| High-level Production of Recombinant Membrane Proteins Using the Engineered Escherichia coli Strains SuptoxD and SuptoxR
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] We have previously described the development of two specialized Escherichia coli strains for high-level recombinant membrane protein (MP) production. These engineered strains, termed SuptoxD and SuptoxR, are capable of suppressing the cytotoxicity caused by MP overexpression and of producing greatly enhanced MP yields. Here, we present a Bio-protocol that describes gene overexpression and culturing conditions that maximize the accumulation of membrane-integrated and well-folded recombinant MPs in these strains.
[摘要] [摘要] 我们之前已经描述了两种用于生产高水平重组膜蛋白（MP）的大肠杆菌菌株的开发。这些工程菌株，称为SuptoxD和SuptoxR，能够抑制MP过度表达引起的细胞毒性，并产生显著提高的MP产量。在这里，我们提出一个生物协议，描述基因过度表达和培养条件，最大限度地积累膜整合和折叠良好的重组多磺酸粘多糖在这些菌株。
[背景]多磺酸粘多糖在所有活生物体的细胞中执行多种关键功能（Wagner et al.，2006；Schlegel et al.，2010），是当前和未来药物的主要靶点（Yildrim et al.，2007）。获得足够数量的分离蛋白是进行生化和结构研究的前提，这反过来又可以加深对其功能的理解，并发现新的MP靶向药物。
由于多磺酸粘多糖通常在其天然环境中以极低的丰度出现，异源宿主通常用于其重组过表达和随后的纯化。许多不同的系统已被用作原核和真核来源的多种多磺酸粘多糖的过表达宿主（Wagner等人，2006年）。其中，大肠杆菌是最受欢迎的一种，因为它的成本非常低，使用方便（Makino等人，2011年）。事实上，这种细菌已经成功地用于生产储存在蛋白质数据库中的所有重组产生的MP结构的大约20%（Dilworth等人，2018年）。尽管有这些优势和成功，但使用大肠杆菌作为MP生产的异源宿主通常伴随着严重的毒性、低水平的最终生物量和微小的最终产量（Miroux和Walker，1996；Wagner等人，2007；Link等人，2008；Gubellini等人，2011）。 ...
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| Isolation of the Dot/Icm Type IV Secretion System Core Complex from Legionella pneumophila for Negative Stain Electron Microscopy Studies
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Legionella possesses a pivotal secretion machinery to deliver virulence factors to eukaryotic host cells. In this protocol, we describe the procedure for isolation of the native core complex of the Dot/Icm type IV secretion system from L. pneumophila aiming to perform biochemical and transmission electron microscopy analyses.
[摘要] 军团菌具有关键的分泌机制，以将毒力因子递送至真核宿主细胞。在本协议中，我们描述了从L / L分离Dot / Icm IV型分泌系统的天然核心复合物的步骤。肺炎支原体旨在进行生物化学和透射电子显微镜分析。
嗜肺军团菌是革兰氏阴性细菌病原体，其导致被称为退伍军人病的肺部感染（Fields等人，2002）。 L。嗜肺杆菌利用由 dot / cm 基因编码的IV型分泌系统（T4SS）将大约300种细菌蛋白转运到其真核宿主细胞质中以劫持细胞过程（Hubber和Roy， 2010）。由超过20种蛋白组成，T4SS是建立在细菌内膜和外膜上的纳米机器（Nagai和Kubori 2011; Kubori和Nagai 2016）。 Dot / Icm T4SS的核心复合物是系统的生物化学稳定部分，并形成桥接内膜和外膜的输送导管（Kubori等人，2014）。核心复合物由至少五种蛋白质组成;三种外膜相关蛋白，DotC，DotD和DotH，以及两种内膜蛋白DotF和DotG（Vincent等人，2006）。基于来自鼠伤寒沙门氏菌的另一种细菌纳米机械的III型分泌系统的生物化学分离方法（Kubori等人，1998; Marlovits等人， ...
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