| A Method for SUMO Modification of Proteins in vitro
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] The Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO) is a protein that is post-translationally added to and reversibly removed from other proteins in eukaryotic cells. SUMO and enzymes of the SUMO pathway are well conserved from yeast to humans and SUMO modification regulates a variety of essential cellular processes including transcription, chromatin remodeling, DNA damage repair, and cell cycle progression. One of the challenges in studying SUMO modification in vivo is the relatively low steady-state level of a SUMO-modified protein due in part to the activity of SUMO deconjugating enzymes known as SUMO Isopeptidases or SENPs. Fortunately, the use of recombinant SUMO enzymes makes it possible to study SUMO modification in vitro. Here, we describe a sensitive method for ...
[摘要] 小泛素相关修饰物（SUMO）是一种蛋白质，其翻译后添加到真核细胞中并可逆地从其他蛋白质中去除。 SUMO和SUMO途径的酶从酵母到人类都很保守，SUMO修饰调节了多种基本细胞过程，包括转录，染色质重塑，DNA损伤修复和细胞周期进程。 研究SUMO修饰体内的挑战之一是SUMO修饰蛋白的相对低的稳态水平，部分原因是SUMO去缀合酶（SUMO Isopeptidases或SENPs）的活性。 幸运的是，使用重组SUMO酶可以在体外研究SUMO修饰。 在这里，我们描述了一种灵敏的方法，用于检测目标人类蛋白质的SUMO修饰，使用来自兔网织红细胞和放射性标记的氨基酸的体外转录和翻译系统。
【背景】与其他泛素蛋白家族修饰一样，SUMO修饰通过ATP依赖性酶促级联发生，涉及E1激活酶（人类中的Aos1 / Uba2异二聚体），E2结合酶（Ubc9）和许多E3连接之一的连续活性。酶（Gareau和Lima，2010）。具有SUMO缀合共有位点的蛋白质ΨKxE（Ψ是疏水残基，其后是赖氨酸，任何氨基酸和谷氨酸），可以通过哺乳动物中表达的一种或几种SUMO旁系同源物（包括SUMO1，SUMO2）进行有效修饰。或SUMO3（统称为SUMO2 / 3，因为它们的序列同源性为97％）（Gareau和Lima，2010; Flotho和Melchior，2013）。 ...
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| Deoxycholate Fractionation of Fibronectin (FN) and Biotinylation Assay to Measure Recycled FN Fibrils in Epithelial Cells
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Fibronectin (FN) is an extracellular matrix protein that is secreted by many cell types and binds predominantly to the cell surface receptor Integrin α5β1. Integrin α5β1 binding initiates the step-wise assembly of FN into fibrils, a process called fibrillogenesis. We and several others have demonstrated critical effects of fibrillogenesis on cell migration and metastasis. While immunostaining and microscopy methods help visualize FN incorporation into fibrils, with each fibril being at least 3 μm in length, the first study that developed a method to biochemically fractionate FN to quantify fibril incorporated FN was published by Jean Schwarzbauer’s group in 1996. Our protocol was adapted from the original publication, and has been tested on multiple cell types including as shown here in ...
[摘要] 纤连蛋白（FN）是一种细胞外基质蛋白，由许多细胞类型分泌，主要与细胞表面受体整合素α5β1结合。整合素α5β1结合启动FN逐步组装成原纤维，这一过程称为原纤维形成。我们和其他几个人已经证明了原纤维形成对细胞迁移和转移的关键作用。虽然免疫染色和显微镜方法有助于可视化FN掺入原纤维，每个原纤维的长度至少为3μm，但是第一项研究开发了一种生物化学分离FN以量化原纤维并入FN的方法，由Jean Schwarzbauer小组于1996年出版。我们的方案改编自原始出版物，并已在多种细胞类型上进行测试，包括如此处所示的MCF10A乳腺上皮细胞和Caki-1肾癌上皮细胞。使用两种洗涤剂提取物，将细胞FN分离成不溶于洗涤剂或掺入原纤维的FN和可溶性FN或未掺入的级分。为了确定原纤维形成是否利用FN的再循环池，我们使用了生物素标记的FN（FN-生物素）再循环测定，其已经从先前的研究中修改。使用再循环测定和脱氧胆酸盐分离方法的组合，可以定量地证明在不同实验条件下细胞中原纤维形成的程度，并确定原纤维形成的FN来源
【背景】 纤连蛋白（FN）是普遍产生的细胞外基质（ECM）组分（Uitto et al。，1989; Mao和Schwarzbauer，2005）。纤连蛋白库是转录产生的，可以通过几种生长因子如TGF-β1增加（Yokoi et al。，2002; Mimura ...
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| Structural Analysis of Bordetella pertussis Biofilms by Confocal Laser Scanning Microscopy
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Biofilms are sessile communities of microbial cells embedded in a self-produced or host-derived exopolymeric matrix. Biofilms can both be beneficial or detrimental depending on the surface. Compared to their planktonic counterparts, biofilm cells display enhanced resistance to killing by environmental threats, chemicals, antimicrobials and host immune defenses. When in biofilms, the microbial cells interact with each other and with the surface to develop architecturally complex multi-dimensional structures. Numerous imaging techniques and tools are currently available for architectural analyses of biofilm communities. This allows examination of biofilm development through acquisition of three-dimensional images that can render structural features of the sessile community. A frequently ...
[摘要] 生物膜是嵌入自生或宿主衍生的外聚合物基质中的微生物细胞的固着群落。根据表面，生物膜可以是有益的或有害的。与浮游生物相比，生物膜细胞表现出更强的抗环境威胁，化学物质，抗菌药物和宿主免疫防御能力。当处于生物膜中时，微生物细胞彼此相互作用并与表面相互作用以形成结构复杂的多维结构。目前，许多成像技术和工具可用于生物膜群落的建筑分析。这允许通过获取可以呈现无柄群落的结构特征的三维图像来检查生物膜的发展。经常使用的工具是共聚焦激光扫描显微镜。我们提出了一个详细的协议，以生长，观察和分析呼吸道人类病原体，百日咳博德特氏菌的生物膜在空间和时间。
【背景】百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）是上呼吸道的专性人类病原体，引起百日咳或百日咳（Mooi，2010; Dorji et al。，2018）。 B的生物膜。百日咳在各种人造表面上以及静态，摇动和流体流动条件下形成（Mishra et al。，2005; Sloan et al。，2007 ; Serra et al。，2011）。对这些生物膜的显微评估表明，这种细菌产生不规则形状的微集落，由流体通道分隔，嵌入由细胞外DNA（eDNA），蛋白质和多糖组成的外聚合物基质中（Parise et al。，2007; Sloan et al。，2007; Serra et al。，2008; ...
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