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Date:
2017-04-20
[Abstract] This protocol describes how to measure protein-protein interactions by microscale thermophoresis (MST) using the MonolithTM NT.115 instrument (NanoTemper). We have used the protocol to determine the binding affinities between three different flavodoxin reductases (FNRs) and a flavodoxin-like protein, NrdI, from Bacillus cereus (Lofstad et al., 2016). NrdI is essential in the activation of the manganese-bound form of the class Ib ribonucleotide reductase (RNR) system. RNRs, in turn, are the only source of the de novo synthesis of deoxyribonucleotides required for DNA replication and repair in all living organisms.
[摘要] 该协议描述了如何使用Monolith TM NT.115仪器（NanoTemper）通过微量热泳法（MST）测量蛋白质 - 蛋白质相互作用。我们已经使用方案来确定三种不同的黄素氧还蛋白还原酶（FNR）和来自蜡样芽孢杆菌（Lofstad等）的黄素氧还蛋白样蛋白NrdI之间的结合亲和力， 2016）。 NrdI对于Ib类核糖核苷酸还原酶（RNR）系统的锰结合形式的活化至关重要。反过来，RNRs是所有生物体中DNA复制和修复所需的脱氧核糖核苷酸合成的唯一来源。
蛋白质 - 蛋白质的相互作用通常以相关的解离常数（K D ）为特征。可以使用诸如等温量热法（ITC），NMR光谱和表面等离子体共振（SPR）的各种技术来建立结合常数。另一种方法是基于热泳法，其中不同分子（例如蛋白质 - 蛋白质复合物与单个蛋白质）对温度梯度的反应不同（Duhr和Braun，2006; Seidel等人， 2013）。该方法快速，不需要样品固定，样品要求较低。简言之，其中一种蛋白质用荧光染料标记并保持在恒定的低浓度。建立稀释系列，其他蛋白质稀释至16倍，产生广泛的浓度范围。随后将两种蛋白质混合并加载到毛细管中，毛细管在Monolith TM ...
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