| Genome Editing in Diatoms Using CRISPR-Cas to Induce Precise Bi-allelic Deletions
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Genome editing in diatoms has recently been established for the model species Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana. The present protocol, although developed for T. pseudonana, can be modified to edit any diatom genome as we utilize the flexible, modular Golden Gate cloning system. The main steps include how to design a construct using Golden Gate cloning for targeting two sites, allowing a precise deletion to be introduced into the target gene. The transformation protocol is explained, as are the methods for screening using band shift assay and/or restriction site loss.
[摘要] 最近为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和海绵假丝酵母（Thalassiosira pseudonana）建立了硅藻基因组编辑。 目前的协议，虽然开发的 T。 pseudonana ，可以修改编辑任何硅藻基因组，因为我们利用灵活，模块化的金门克隆系统。 主要步骤包括如何设计构建使用金门克隆靶向两个网站，允许一个精确的删除被引入目标基因。 解释转化方案，以及使用带移位测定和/或限制性位点丢失进行筛选的方法。
【背景】CRISPR-Cas正在迅速成为分子研究的一个关键方法。基于在细菌和古细菌中发现的病毒防御机制，CRISPR-Cas诱导基因组中精确位置的双链断裂（DSBs）。它涉及使用与CRISPR ...
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| Immunoprecipitation of Cell Surface Proteins from Gram-negative Bacteria
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] The meningococcus (Neisseria meningitidis) remains an important threat to human health worldwide. This Gram-negative bacterium causes elevated disabilities and mortality in infected individuals. Despite several available vaccines, currently there is no universal vaccine against all circulating meningococcal strains (Vogel et al., 2013). Herein, we describe a new protocol that is capable of identifying only cell surface exposed proteins that play a role in immunity, providing this research field with a more straightforward approach to identify novel vaccine targets. Even though N. meningitidis is used as a model in the protocol herein described, this protocol can be used for any Gram-negative bacteria provided modifications and optimizations are carried out to ...
[摘要] 脑膜炎球菌（脑膜炎奈瑟氏球菌）仍然是全球人类健康的重大威胁。这种革兰氏阴性细菌导致感染个体的残疾和死亡率升高。尽管有几种可用的疫苗，目前还没有针对所有循环脑膜炎球菌菌株的通用疫苗（Vogel等人，2013）。在这里，我们描述了一种能够识别仅在细胞表面暴露的蛋白质在免疫中发挥作用的新方案，为该研究领域提供了一种更直接的方法来鉴定新的疫苗靶标。即使使用脑膜炎奈瑟氏球菌作为本文所述方案中的模型，该方案可用于任何革兰氏阴性细菌，提供修饰和优化以使其适应不同的细菌和疾病特征（例如薄膜脆性，生长方法，血清抗体水平，等等）。
背景 尝试开发针对N型的新型疫苗。脑膜炎脑膜炎常常依赖于2D SDS-PAGE（二维十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳）和蛋白质印迹，随后MS（质谱）（Wheeler等人，2007））。然而，这种方法采用全细胞裂解物，鉴定出不具有疫苗潜力的大量蛋白质（Mendum等人，2009）。因此，我们旨在开发一种能够鉴别可能在免疫中起重要作用的细胞表面暴露蛋白质的方法。简言之，我们的方案包括生长感兴趣的病原体，用免疫个体的血清免疫沉淀表面抗原，并通过液相色谱 - ...
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| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of the process is demonstrated by the simultaneous deletion of up to four programmed cell death mediators in leukemic cell lines and patient-derived acute lymphoblastic leukemia xenografts, in which ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
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