| Production and Isolation of Magnetic Protein Crystals in HEK293T Cells
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Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] Advances in protein engineering have enabled the production of self-assembled protein crystals within living cells. Our recent publication demonstrates the production of ftn-PAK4, which is a ferritin-containing crystal that can mineralize iron and become magnetic when isolated. We have developed an optimized protocol for the production and isolation of PAK4-based crystals. The crystals are first grown in low-passage HEK293T cells, released using a lysis buffer containing NP-40 and DNase, and collected under careful centrifugation conditions. Our protocol maximizes the purity and yield of crystals and is quick and straightforward.
[摘要] [摘要] 蛋白质工程的进展已使活细胞内产生自组装的蛋白质晶体。我们的最新出版物证明了ftn-PAK4的生产，它是一种含铁蛋白的晶体，在分离时可以矿化铁并成为磁性。我们已经开发出用于生产和分离基于PAK4的晶体的优化协议。晶体首先在低传代的HEK293T细胞中生长，使用含有NP-40和DNase的裂解缓冲液释放，并在仔细的离心条件下收集。我们的协议可最大程度地提高晶体的纯度和收率，并且操作简便快捷。
[背景] 近来的作品曾报道的“生产和隔离在纤维素的” 晶体通过蛋白在活细胞中的异源表达。这些晶体具有多种应用，例如货物运输（Ijiri 等，2009）或X射线结构测定（Baska ran 和Ang ，2015）。晶体的性质而变化，但它们通常相对于相当大的是对细胞，范围从1-2 微米到数百微米的大小（圣豪等人，2015） 。在我们最近的工作中，我们修改了inka-PAK4晶体以创建ftn-PAK4，该ftn-PAK4是一种含铁蛋白的晶体，可以矿化足够的铁以吸引附近的永磁体（Li 等，2019）。
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| Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Oxidative stress is implicated in the pathogenesis of various neurodegenerative diseases, including Alzheimer’s disease. Oxidative stress is a result of a disruption of the equilibrium between antioxidants and oxidants, in favor of oxidants. Since mitochondria are major sites of production and reduction of reactive oxygen species (ROS), measurement of ROS levels can help us determine if mitochondrial functional integrity has been compromised. In this protocol, we describe a method to measure the level of ROS in the nematode Caenorhabditis elegans, using chloromethyl-2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (CM-H2DCFDA).
[摘要] 氧化应激涉及各种神经退行性疾病的发病机制，包括阿尔茨海默病。 氧化应激是抗氧化剂和氧化剂之间平衡中断的结果，有利于氧化剂。 由于线粒体是主要的产生和活性氧（ROS）减少的部位，ROS水平的测量可帮助我们确定线粒体功能完整性是否受到损害。 在该协议中，我们描述了使用氯甲基-2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H 2），测量线虫秀丽隐杆线虫中ROS的水平的方法，DCFDA）。
【背景】ROS的生命周期与线粒体密切相关。超氧化物是由于线粒体中电子传递链的复合物I和复合物III不可避免地发生电子泄漏而产生的。这种超氧化物然后在线粒体基质和线粒体膜间隙中被过氧化氢歧化。通过这些过程产生的超氧化物和过氧化氢被认为是ROS，其中线粒体负责90％的内源性ROS（Balaban等人，2005）。因此，测量ROS水平将提供对线粒体健康状况的了解。在这里，我们提供了一个协议来确定线虫中的ROS水平。使用CM-H 2 DCFDA（一种还原形式的荧光素的渗透细胞氯甲基衍生物）的线虫。一旦进入细胞内，CM-H 2 DCFDA被细胞内酯酶切割，并且由ROS产生的氧化产生的非荧光H 2 DCF被转化为高度荧光的2 '，7'-二氯荧光素（DCF）。活体C中H 2 DCFDA的荧光强度的成像和测量。 elegans ...
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| In vitro Detection of Neutrophil Traps and Post-attack Cell Wall Changes in Candida Hyphae
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] In this protocol we describe how to visualize neutrophil extracellular traps (NETs) and fungal cell wall changes in the context of the coculture of mouse neutrophils with fungal hyphae of Candida albicans. These protocols are easily adjusted to test a wide array of hypotheses related to the impact of immune cells on fungi and the cell wall, making them promising tools for exploring host-pathogen interactions during fungal infection.
[摘要] 在本协议中，我们描述了如何在小鼠嗜中性粒细胞与真菌白色念珠菌的真菌菌丝共培养的背景下观察嗜中性粒细胞胞外捕获物（NETs）和真菌细胞壁变化。 这些方案很容易调整，以测试与免疫细胞对真菌和细胞壁的影响有关的各种假设，使其成为探索真菌感染期间宿主病原体相互作用的有前景的工具。
C。白色念珠菌是一种多态性机会性酵母，嗜中性粒细胞是免疫细胞，对于这种和其他真菌病原体的防御至关重要（Brown等，2012; Lionakis和Netea，2013）。 NETs是可以针对病原体部署的潜在防御机制，并且已经表明它们优先针对诸如C的微生物细胞部署。白念珠菌菌丝太大而不能吞噬（Urban et al。，2006; Bruns等人，2010; Branzk等人，，2014; Rohm等人，2014）。 NET已经显示含有许多组分，包括髓过氧化物酶，胞外DNA和瓜氨酸化的组蛋白（Amulic等人，2012; ...
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