| Melanoma Stem Cell Sphere Formation Assay
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Self-renewal is the ability of cells to replicate themselves at every cell cycle. Throughout self-renewal in normal tissue homeostasis, stem cell number is maintained constant throughout life. Cancer stem cells (CSCs) share this ability with normal tissue stem cells and the sphere formation assay (SFA) is the gold standard assay to assess stem cells (or cancer stem cells) self-renewal potential in vitro. When single cells are plated at low density in stem cell culture medium, only the cells endowed with self-renewal are able to grow in tridimensional clusters usually named spheres. In the recent years, SFA has also been used also to test the effect of several drugs, chemical and natural compounds or microenviromental components on stem cells self-renewal capacity. Here we will ...
[摘要] 自我更新是细胞在每个细胞周期复制自身的能力。在正常组织体内平衡的自我更新过程中，干细胞数量在整个生命中保持不变。癌症干细胞（CSCs）与正常组织干细胞共享这种能力，球形成测定（SFA）是评估干细胞（或癌症干细胞）体外自我更新潜力的金标准测定方法。 。当单细胞在干细胞培养基中以低密度铺板时，仅具有自我更新的细胞能够在通常称为球体的三维簇中生长。近年来，SFA也用于测试几种药物，化学和天然化合物或微环境成分对干细胞自我更新能力的影响。在这里，我们将说明一个详细的方案来评估人类黑色素瘤干细胞的自我更新，作为黑色球体生长。
癌症干细胞（CSCs）首先在急性骨髓瘤白血病（Lapidot et al。，1994）中发现，然后在许多实体瘤中鉴定出包括黑素瘤。 CSCs被定义为具有自我更新和肿瘤起始能力的细胞，能够在体内再生整个肿瘤异质性。可以使用基于表型特征或生物学特性的不同方法从肿瘤块中分离CSCs，然后在体外（自我更新）和体内 （致瘤潜力）。使用细胞表面标志物的组合分离黑素瘤CSCs（Fang等人，2005; Monzani等人，2007; Schatton等人， ，2008; Boiko等人，2010; Boonyaratanakornkit等人，2010）或通过特定干细胞培养基中的培养（Perego等人， ，2010; Santini ...
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| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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