| DigiTAG–a RNA Sequencing Approach to Analyze Transcriptomes of Rare Cell Populations in Drosophila melanogaster
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Author:
Date:
2020-11-05
[Abstract] Cell-type specific transcriptional programs underlie the development and maintenance of organs. Not only distinct cell types within a tissue, even cells with supposedly identical cell fates show a high degree of transcriptional heterogeneity. Inevitable, low cell numbers are a major hurdle to study transcriptomes of pure cell populations. Here we describe DigiTAG, a high-throughput method that combines transposase fragmentation and molecular barcoding to retrieve high quality transcriptome data of rare cell types in Drosophila melanogaster. The protocol showcases how DigiTAG can be used to analyse the transcriptome of rare neural stem cells (type II neuroblasts) of Drosophila larval brains, but can also be utilized for other cell types or model systems.
[摘要] [摘要]细胞类型的特定转录程序是器官的发育和维持的基础。不仅组织内不同的细胞类型，甚至具有相同细胞命运的细胞也显示出高度的转录异质性。不可避免的是，低细胞数量是研究纯细胞群体转录组的主要障碍。在这里，我们介绍DigiTAG ，这是一种高通量方法，将转座酶片段化和分子条形码相结合，以检索果蝇中稀有细胞类型的高质量转录组数据。该协议展示了DigiTAG如何可用于分析果蝇幼虫的罕见神经干细胞（II型成神经细胞）的转录组 大脑，但也可以用于其他细胞类型或模型系统。
[背景]在发育过程中，不同细胞类型之间的过渡与组织稳态之间的关系是由大量转录因子及其诱导的转录变化所精心安排的。在过去的十年中，RNA测序（RNA- seq ）已成为测量整个基因组转录动力学的经典方法（Stark等，2019）。组织上的大量RNA序列不允许研究不同细胞群体的转录网络，特别是稀有细胞类型的转录网络。因此，需要提供低输入样品高质量转录组的RNA- seq方案。
在果蝇中，有限的材料通常构成分析特定组织或细胞类型的障碍。果蝇神经干细胞（称为神经母细胞）很好地说明了这一点（Homem和Knoblich ，2012）。存在成神经细胞的几个不同的亚群。例如，在果蝇的幼虫大脑中，只有16种II型成神经细胞产生神经元，神经元支配了运动和感觉处理所需的大脑区域（Walsh and ...
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| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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