| Plant ARGONAUTE Protein Immunopurification for Pathogen Cross Kingdom Small RNA Analysis
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Author:
Date:
2021-02-05
[Abstract] Over the last decade, it has been noticed that microbial pathogens and pests deliver small RNA (sRNA) effectors into their host plants to manipulate plant physiology and immunity for infection, known as cross kingdom RNA interference. In this process, fungal and oomycete parasite sRNAs hijack the plant ARGONAUTE (AGO)/RNA-induced silencing complex to post-transcriptionally silence host target genes. We hereby describe the methodological details of how we recovered cross kingdom sRNA effectors of the oomycete pathogen Hyaloperonospora arabidopsidis during infection of its host plant Arabidopsis thaliana. This Bio-protocol contains two parts: first, a detailed description on the procedure of plant AGO/sRNA co-immunopurification and sRNA recovery for Illumina high throughput sequencing ...
[摘要] [摘要]在过去的十年中，已经注意到，微生物病原体和害虫将小RNA（sRNA）效应子传递到宿主植物中，以操纵植物生理学和免疫力，称为跨界RNA干扰。在此过程中，真菌和卵菌寄生虫sRNA劫持了植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合体，以转录后沉默宿主靶基因。我们在此描述方法学的细节，我们如何在宿主植物拟南芥感染期间恢复卵菌病原体拟南芥的跨界sRNA效应子。该生物协议包含两个部分：第一，关于植物AGO / sRNA co- 免疫纯化和sRNA回收，用于Illumina高通量测序分析。其次，我们解释了如何进行生物信息学小号斯尔纳序列分析读取可使用Galaxy服务器。原则上，该协议适用于研究来自多种宿主植物和植物相互作用（微生物）的AGO结合的sRNA。
[背景]小RNA（sRNA）可以充当病原体效应物，劫持植物ARGONAUTE（AGO）/ RNA诱导的沉默复合物（RISC），并使宿主mRNA沉默以进行感染，这种病毒被称为跨界RNA干扰的毒力机制（Weiberg等。，2015； Zeng等，2019）。分析感染期间与植物AGO结合的sRNA的库是一种选择方法，以全面了解可能通过宿主AGO / RISC起作用的植物入侵性病原体sRNA。基于抗体的植物AGO / ...
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| Extraction of Soluble and Insoluble Protein Fractions from Mouse Brains and Spinal Cords
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The current protocol details the preparation of soluble and insoluble protein lysates from mouse brain or spinal cord samples. In detail, tissue homogenization and sequential protein extraction are described. This procedure yields soluble and insoluble protein extracts that can be further processed in down-stream applications like ELISA or Western blotting.
[摘要] 目前的方案详述了从小鼠脑脊髓样品中制备可溶性和不溶性蛋白质裂解物。 详细地描述了组织匀浆和顺序蛋白质提取。 该方法产生可溶性和不溶性蛋白质提取物，其可以在下游应用中进一步加工，如ELISA或Western印迹法。
【背景】这种简单且可重现的脑组织蛋白分离方案详述了总蛋白匀浆物初始分离成可溶性和不溶性级分。 它也可以应用于其他组织样品，并产生含有亲水性蛋白质的可溶性级分和由更疏水的蛋白质组成的不溶性级分。 在不含洗涤剂的裂解缓冲液中进行初始均化后，除去含有可溶性蛋白质级分的上清液，并且可以使用十二烷基硫酸钠（SDS）作为洗涤剂进一步提取含有不溶性级分的沉淀物，以确保全细胞裂解（参见图1）。 这种方法可以通过降低样品的复杂性来促进低丰度蛋白质的分析。
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图1.描述顺序提取过程的流程图
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| ARP2/3 Phosphorylation Assay in the Presence of Recombinant Bacterial Effectors
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The Actin-Related Protein 2/3 (ARP2/3) complex is an actin nucleator that generates a branched actin network in mammalian cells. In addition to binding nucleation promoting factors, LeClaire et al. demonstrated that its phosphorylation state is essential key for its activity (LeClaire et al., 2008). In cells, the ARP2/3 complex is phosphorylated on threonine and tyrosine residues of the ARP2, ARP3, and ARPC1 subunits (Vadlamudi et al., 2004; LeClaire et al., 2008; Narayanan et al., 2011; LeClaire et al., 2015). In particular, phosphorylation of threonine 237 and 238 of the ARP2 subunit is necessary to allow a change in the ARP2/3 complex structure to its active conformation (Narayanan et al., 2011; LeClaire et al., ...
[摘要] 肌动蛋白相关蛋白2/3（ARP2 / 3）复合物是在哺乳动物细胞中产生支链肌动蛋白网络的肌动蛋白成核剂。除了结合成核促进因子之外，LeClaire等人。证明其磷酸化状态是其活性的关键（LeClaire等人，2008）。在细胞中，ARP2 / 3复合物在ARP2，ARP3和ARPC1亚基的苏氨酸和酪氨酸残基上磷酸化（Vadlamudi等人，2004; LeClaire等人）。 ，2008; Narayanan等人，2011; LeClaire等人，2015）。特别地，ARP2亚基的苏氨酸237和238的磷酸化对于允许将ARP2 / 3复合物结构改变为其活性构象是必要的（Narayanan等人，2011; LeClaire等人al ，2015）。虽然对于真核细胞中的许多功能很重要，但ARP2 / 3复合物活性也有利于多种细胞病原体（Haglund和Welch，2011; Welch和Way，2013）。最近，我们证明细菌病原体，嗜肺军团菌，使用注射在宿主细胞质细胞中的细菌蛋白激酶来操纵ARP2 / 3复合磷酸化状态（Michard等人，2015） ）。在这里，我们描述如何测试细菌蛋白激酶或另一种蛋白激酶在体外上下文中磷酸化ARP2 / 3复合物的能力。首先，产生和纯化ARP2 / 3复合物和细菌蛋白激酶。然后，将纯化的蛋白质在ATP存在下培养，并通过Western印迹分析ARP2 / ...
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