| Preparation of Bacterial Outer Membrane Vesicles for Characterisation of Periplasmic Proteins in Their Native Environment
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Author:
Date:
2020-12-20
[Abstract] Bacterial outer membrane vesicles (OMVs) are naturally formed by budding from the outer membrane of Gram-negative bacteria. OMVs consist of a lipid bilayer identical in composition to the original outer membrane and contain periplasmic content within their lumen. Enriched with specific envelope proteins, OMVs make for an excellent native-like platform to study these proteins in-situ using biophysical methods. Here, we describe in detail the preparation of OMVs from Escherichia coli, which are luminally enriched with periplasmic proteins and uniformly labeled with stable isotopes (2H and 15N), suitable for the subsequent characterisation of proteins at atomic resolution in their native environment by solution-state NMR spectroscopy. The ability to perform structural studies of periplasmic ...
[摘要] [摘要]细菌外膜囊泡（OMV）是由革兰氏阴性细菌的外膜出芽自然形成的。OMV由组成与原始外膜相同的脂质双层组成，并且在其内腔中含有周质成分。OMV富含特定的包膜蛋白，是使用生物物理方法原位研究这些蛋白的绝佳天然样平台。在这里，我们详细描述了从大肠杆菌制备OMV的方法，该方法在光亮时富含周质蛋白，并用稳定的同位素（2 H和15 N）均匀标记，适用于后续表征溶液状态NMR光谱分析天然环境中蛋白质的原子分辨率。执行周质成分的结构研究的能力，现场清除的方式来REAC兴的这种独特的细胞室的功能和机理细节的深入了解。
[背景]革兰氏阴性菌的周质是一个相当了不起的细胞室。这个空间中，内和外细菌膜之间禁闭，包含在抽蛋白一个ö ř dinarily高浓度超过300毫克毫升-1 （奥利弗，1996） ，并且在不存在的细胞来源，如ATP，功能几乎大力独立从其胞质对应物。到目前为止，有关周质蛋白的结构知识是使用从其天然环境分离的纯化蛋白专门获得的。因此，这种特殊环境可能对蛋白质施加的任何结构和功能影响在纯化过程中都会丢失。由于周质的体积比低，阻碍了使用生物物理方法如细胞内NMR光谱原位研究周质蛋白的努力，周质的体积比仅占细菌总体积的5-1 0％（Brass等，1986）。 ）。
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| Nitroxide Labeling of Proteins and the Determination of Paramagnetic Relaxation Derived Distance Restraints for NMR Studies
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] Site-specific attachment of paramagnetic spin labels to biomolecules causes distance-dependent line-broadening effects, which can be exploited to study the structure and dynamics of these molecules in solution. This protocol describes how to attach nitroxide spin labels to proteins and how to collect and analyze NMR data using these labeled samples. We also explain how to derive distance restraints for paramagnetic relaxation enhancement nuclear magnetic resonance (PRE-NMR) studies.
[摘要] 顺磁自旋标记与生物分子的位点特异性连接导致距离依赖性线宽增加效应，可用于研究溶液中这些分子的结构和动力学。 该协议描述了如何将氮氧自由标记连接到蛋白质上，以及如何使用这些标记的样品收集和分析NMR数据。 我们还解释了如何导出顺磁性松弛增强核磁共振（PRE-NMR）研究的距离约束。
该协议描述了如何使用顺磁性松弛增强核磁共振（PRE-NMR）方法将氮氧自由标记附着到蛋白质上以及如何使用修饰的蛋白质来导出距离约束。顺磁自旋标记对蛋白质的位点特异性附着增强了附近细胞核的横向松弛率，导致了可用于导出距离约束的线宽变化效应（Battiste和Wagner，2000; Iwahara等人。 ，2004; Clore和Iwahara，2009）。已经使用PRE衍生的距离限制来表征各种分子的结构，包括膜蛋白（Roosild等人，2005），显示域间动力学的多结构域蛋白（Sjodt 单链蛋白（Battiste和Wagner，2000），蛋白质-DNA复合物（Clore和Iwahara，2009），瞬时蛋白质 - 蛋白质相互作用（Tang等人， ，2007; ...
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