Precision Tagging: A Novel Seamless Protein Tagging by Combinational Use of Type II and Type IIS Restriction Endonucleases
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Date:
2018-02-05
[Abstract] Protein tagging is a powerful tool for performing comprehensive analyses of the biological functions of a protein of interest owing to the existence of a wide variety of tags. It becomes indispensable in some cases, such as in tracking protein dynamics in a live cell or adding a peptide epitope due to the lack of optimal antibodies. However, efficiently integrating an array of tags into the gene of interest remains a challenge. Traditional DNA recombinant technology based on type II restriction endonucleases renders protein tagging tedious and inefficient as well as the introduction of an unwanted junction sequence. In our attempt to tag Thrombospondin type 1 domain-containing 1 (THSD1) that we identified as the first intracranial aneurysm gene (Santiago-Sim et al., 2016), we ...
[摘要] 由于各种标签的存在,蛋白质标签是一种对感兴趣的蛋白质的生物学功能进行全面分析的有力工具。在某些情况下,例如跟踪活细胞中的蛋白质动态变化或由于缺乏最佳抗体而添加肽表位,这变得不可或缺。然而,将一系列标签有效地整合到感兴趣的基因中仍然是一个挑战。基于II型限制性内切核酸酶的传统DNA重组技术使得蛋白质标记繁琐且效率低下以及引入不需要的连接序列。我们试图标记我们确定为第一个颅内动脉瘤基因的血小板反应蛋白1型结构域1(THSD1)(Santiago-Sim等人,2016),我们开发了一种新型精确标记技术,组合使用II型和IIS限制性核酸内切酶(Xu等人,2017),其产生高效率的无缝克隆。在这里,我们描述了一个协议,不仅为任何感兴趣的基因提供了一个广义的策略,而且还将THSD1中的11个不同标签的应用作为一个循序渐进的例子。
【背景】具有不同特征的多功能标签可以作为一组分析蛋白质功能的工具。诸如绿色荧光蛋白(GFP)标签及其衍生物,串联亲和纯化标签(如FLAG-HA或ProtA-CBP)的各种标签多年来革新了生物学研究。一些新开发的化学标签,如SNAP或CLIP,允许以时间控制的方式有条件地标记感兴趣的蛋白质(Bodor等人,2012)。然而,有效地将尽可能多的不同标签整合到感兴趣的基因中的方法发展不足。
传统的DNA重组利用识别回文序列的II型限制性内切核酸酶。例如,Eco ...
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Cell-free Generation of COPII-coated Procollagen I Carriers
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2017-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to generate COPII-coated procollagen I (PC1) carriers in a cell-free reaction. The COPII-coated PC1 carriers were reconstituted from donor membrane, cytosol, purified recombinant COPII proteins, and nucleotides. This protocol describes the preparation of donor membrane and cytosol, the assembly of the reaction, and the isolation and detection of reconstituted COPII-coated carriers. This cell-free reaction can be used to test conditions that stimulate or suppress the packaging of PC1 into COPII-coated carriers.
[摘要] 该协议的目的是在无细胞反应中产生COPII包被的前胶原I(PC1)载体。 COPII包被的PC1载体由供体膜,胞质溶胶,纯化的重组COPII蛋白和核苷酸重构。 该方案描述了供体膜和细胞溶胶的制备,反应的组装,以及复制的COPII包被的载体的分离和检测。 该无细胞反应可用于测试刺激或抑制PC1包装成COPII包被的载体的条件。 【背景】外壳蛋白复合体II(COPII)在从内质网(ER)途径到高尔基体的运输中起着至关重要的作用。来自ER的货物运输所需的基因在酵母的基因研究中被发现,并且借助于添加有纯化组分的无细胞囊泡萌芽反应来阐明囊泡出芽所需基因的蛋白质产物的精确作用(Novick 1981; Kaiser等人,1990; Barlowe等人,1994)。开发了类似的反应来检测COPII在培养的哺乳动物细胞中来自ER的货物运输中的作用(Kim等人,2005)。哺乳动物COPII包被的囊泡直径大约为80-100nm,似乎太小以至于不能容纳诸如刚性的300nm前胶原I(PC1)三股螺旋杆的大分泌性货物。尽管可能的尺寸差异,COPII对于包括PC1在内的大型货物的分泌是必不可少的(Boyadjiev等人,2006)。最近,我们报道了通过随机光学重建显微镜(STORM),相关光电子显微镜(CLEM)和活细胞成像(Gorur ...
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RNA Strand Displacement Assay for Hepatitis E Virus Helicase
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Date:
2017-04-05
[Abstract] The hepatitis E virus (HEV) helicase uses ATP to unwind the RNA duplexes. This is an essential step for viral replication. This protocol aims to measure the double strand RNA unwinding activity of the HEV helicase.
[摘要] 乙型肝炎病毒(HEV)解旋酶使用ATP来解开RNA双链体。 这是病毒复制的重要步骤。 该方案旨在测量HEV解旋酶的双链RNA展开活性。
已经使用放射性标记的双链RNA(dsRNA,Karpe等人,2010)测量了HEV解旋酶的RNA展开活性。 我们已经建立了用于测量HEV解旋酶的dsRNA展开活性的非放射性测定方案。 该测定利用荧光标记的RNA来测量从人肝癌细胞纯化的HEV解旋酶蛋白的活性,从而消除了处理放射性物质的需要。
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