| Fluorescent Measurement of Synaptic Activity Using FM Dyes in Dissociated Hippocampal Cultured Neurons
|
|
Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Release and recycling of synaptic vesicles are essential for neurotransmission and synaptic plasticity. To gain mechanistic understanding of these processes, direct measurements of vesicle release and retrieval is indispensable. Styryl dyes like FM1-43 and FM4-64 have been widely used for this purpose and their loading and unloading are reliable measurements for synaptic vesicle release and retrieval in cultured neurons. This protocol describes in detail the procedure of using styryl dyes to label and measure synaptic vesicle uptake and release in cultured rat hippocampal neurons. We also include a brief description of hippocampal culture. In the end, we briefly discuss the commonality and difference among FM dye, pH-sensitive fluorescent proteins and quantum dots in terms of measuring ...
[摘要] 突触小泡的释放和再循环对于神经传递和突触可塑性是至关重要的。 为了获得对这些过程的机械理解，直接测量囊泡释放和回收是必不可少的。 苯乙烯基染料如FM1-43和FM4-64已被广泛用于此目的，其装载和卸载是可靠的测量突触小泡释放和恢复培养的神经元。 该协议详细描述了使用苯乙烯基染料来标记和测量培养的大鼠海马神经元中的突触小泡摄取和释放的程序。 我们还包括对海马文化的简要描述。 最后，我们简要讨论FM染料，pH敏感荧光蛋白和量子点在测量突触小泡行为方面的共性和差异。
【背景】突触小泡是神经传递不可或缺的，因为它们是化学突触中负责神经递质释放的唯一细胞器。它们的数量，释放概率，融合动力学和再循环路线定义了突触传递和神经元交流。已经开发了多种用于探测突触囊泡的工具，包括突触后神经元的电生理学记录，膜运输的电容测量，可氧化的发射体的电流分析，固定突触的电子显微镜成像以及活神经元中的囊泡标记的荧光成像。在所有现有的方法中，最后一个是不仅产生关于个体突触的空间和时间信息，而且提供高吞吐量（即，来自不同神经元的单个突触的更多数据点）的唯一方法。已经开发了基于不同定向和报告机制的各种荧光探针。二十多年前发明的苯乙烯基染料（即FM染料，包括FM1-43，FM4-64，FM5-95）仍然是一种可靠而方便的工具。由于其对脂质膜的中等亲和力及其对脂质敏感的排放，可以容易地装载到再循环的突触囊泡中并且当这些囊泡被胞吐出时释放。使用更敏感的光电探测器如EMCCD，FM染料可以报告单个囊泡释放事件。在这里，我们提供了一个相对完整的基于FM的啮齿动物海马神经元原代培养的突触小泡释放成像的描述。此外，我们还讨论了FM染料和其他荧光泡标签的共性和区别。 ...
|
|
|
| In vitro Assay to Assess Efficacy of Potential Antiviral Compounds against Enterovirus D68
|
|
Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] In 2014 enterovirus D68 (EV-D68) caused the largest outbreak in the United States since the discovery of the virus. Distinct from before, the 2014 infections were associated with more severe respiratory disease and occasional neurological complications. So far, there are no available vaccines or antivirals for the prophylaxis or treatment of EV-D68 infections. In order to evaluate the antiviral activity of potential inhibitors of EV-D68 replication, a cell-based cytopathic effect (CPE) reduction assay was developed (Sun et al., 2015).
[摘要] 2014年肠病毒D68（EV-D68）自发现病毒以来，在美国引起了最大的爆发。与之前不同的是，2014年感染与更严重的呼吸道疾病和偶尔的神经系统并发症有关。到目前为止，还没有可用的疫苗或抗病毒药物用于预防或治疗EV-D68感染。为了评估EV-D68复制潜在抑制剂的抗病毒活性，开发了基于细胞的细胞病变效应（CPE）降低测定法（Sun等，2015）。
背景 作为新出现的病原体，以前很少报道靶向EV-D68的抗病毒化合物。迫切需要建立和开发抗病毒方法来对抗潜在的EV-D68流行病。在这里，我们报告一个详细的方案，可用于识别选择性抗EV-D68化合物。为了筛选和鉴定潜在的抗病毒化合物，基于MTS的CPE降解测定法是可重复使用的，易于使用和省时的方法，被广泛使用。该方法依赖于化合物抑制EV-D68诱导的CPE降低的能力。当化合物主动抑制EV-D68的复制时，病毒诱导的CPE将被减少或不存在。因此，代谢活性细胞能够将黄色四唑盐底物（MTS / PMS）转化为棕色甲an制品。当化合物不具有抗病毒作用时，宿主细胞死于病毒诱导的CPE，其将缺乏代谢活性，并且黄色底物保持未代谢。比色转化是定量的，因为可以从该测定产生的数据计算EC 50。
|
|
|