| Identification of Buffer Conditions for Optimal Thermostability and Solubility of Herpesviral Protein UL37 Using the Thermofluor Assay
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Structural and biochemical studies of proteins require high amounts of stable, purified proteins. Protein stability often depends on the buffer composition, which includes pH and concentration of salts or other solutes such as glycerol, hence an efficient method for identifying optimal buffer conditions for stability would minimize time and resources used for protein purification and further studies. This protocol describes the use of the Thermofluor assay, in combination with a custom 24-condition screen, to identify buffer conditions that increase protein thermostability, using the conserved herpesviral protein UL37 as an example. Detailed instructions on screen conditions, running the Thermofluor MATLAB script, and analyzing the data are provided. In comparison to circular dichroism ...
[摘要] [摘要]蛋白质的结构和生化研究需要大量稳定、纯化的蛋白质。蛋白质的稳定性通常取决于缓冲液的组成，其中包括pH值和盐或其他溶质（如甘油）的浓度，因此，确定最佳缓冲液稳定性条件的有效方法可以将用于蛋白质纯化和进一步研究的时间和资源减至最少。本协议描述了使用热氟分析，结合自定义的24条件筛选，以确定缓冲条件，增加蛋白质热稳定性，使用保存的疱疹病毒蛋白UL37为例。详细说明了屏幕条件，运行Thermofluor的MATLAB脚本，并对数据进行了分析。与圆二色谱法（CD）相比，缓冲屏结合热荧光分析法为蛋白质热稳定性分析提供了一种快速、信息量大的方法。
[背景]蛋白UL37在疱疹病毒的生命周期中具有多种功能，是高效病毒复制所必需的。作为病毒膜的一个组成部分——夹在包含衣壳和脂质膜的基因组之间的一层——UL37不仅是病毒组装所必需的（Desai等人，2001年；Jambunathan等人，2014年），而且也是有效的衣壳运输（Leege等人，2009年）、神经入侵（Richards等人，2017年）和对抗宿主天然免疫应答（Liu等人，2008；Zhao等人，2016）。要更好地理解其多功能性的本质，就需要对其结构和生化特性有详细的了解，而这又需要性能良好的纯化蛋白质。
不同UL37结构体的初始制备在溶解度、单分散性和纯化蛋白的产率方面存在差异，使得蛋白制备不一致，进一步的表征也不可重现。由于缓冲优化是解决这些问题的直接方法，我们开发了一种24条件筛选法，可以改变缓冲剂、pH值以及NaCl和甘油的浓度，并将其与热氟分析法结合使用（Phillips等人，2011年），以确定最大限度提高热稳定性的缓冲条件。UL37的N端和C端具有可变的平均热稳定性和最佳缓冲条件（图1，表1）。然而，在所有情况下，提高蛋白质稳定性的条件也提高了蛋白质的溶解度，最终提高了纯化蛋白质的产量，从而促进了下游的生化特性。 ...
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| Purification of RNA Mango Tagged Native RNA-protein Complexes from Cellular Extracts Using TO1-Desthiobiotin Fluorophore Ligand
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] A native purification strategy using RNA Mango for RNA based purification of RNA-protein complexes is described. The RNA Mango aptamer is first genetically engineered into the RNA of interest. RNA Mango containing complexes obtained from cleared cellular native extracts are then immobilized onto TO1-Desthiobiotin saturated streptavidin agarose beads. The beads are washed to remove non-specific complexes and then the RNA Mango containing complexes are eluted by the addition of free biotin to the beads. Since the eluted complexes are native and fluorescent, a second purification step such as size exclusion chromatography can easily be added and the purified complexes tracked by monitoring fluorescence. The high purity native complexes resulting from this two-step purification strategy can ...
[摘要] 描述了使用RNA Mango进行RNA-蛋白质复合物的RNA纯化的天然纯化策略。 RNA芒果适体首先被基因工程改造成感兴趣的RNA。 然后将从清除的细胞天然提取物获得的含有RNA复合物的复合物固定在TO1-Desthiobiotin饱和的链霉亲和素琼脂糖珠上。 洗涤珠粒以去除非特异性复合物，然后通过向珠粒中加入游离生物素来洗脱含RNA芒果的复合物。 由于洗脱的复合物是天然的和荧光的，所以可以容易地添加第二纯化步骤如尺寸排阻色谱，并且通过监测荧光追踪纯化的复合物。 通过这种两步纯化策略产生的高纯度天然复合物可以用于进一步的生物化学表征。
【背景】目前的RNA标签受限于诸如差K ，大尺寸，潜在的生物学干扰或缺乏固有荧光的限制（Panchapakesan等人， 2015年）。 RNA芒果很小，可以简单地整合到茎环结构中，特别是GNRA tetraloops中，它具有生物耐受性，并且最重要的是对其噻唑橙基（TO1）配体TO1-Desthiobiotin（TO1-Dtb）具有高亲和力。 ...
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| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included intra-nucleosomal H3 crosslinking using dimethyl suberimidate (DMS). Here, we provide a detailed protocol for the use of DMS to analyze yeast nucleosomes.
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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