| Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) Assay for Determination of Molecular Interactions in Living Cells
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay can be used as an indicator of molecular approximation and/or interaction. A significant resonance energy transfer signal is generated when the acceptor, having the appropriate spectral overlap with the donor emission, is approximated with the donor. In the example provided, proteins tagged with bioluminescent Renilla luciferase (Rlu) as donor and yellow fluorescent protein (YFP) as acceptor were co-expressed in cells. This pair of donor and acceptor have an approximate Förster distance of 4.4 nm, providing the optimal working distance (Dacres et al., 2010). This technique can be used to explore the time-course of specific molecular interactions that occur in living cells.
[摘要] 生物发光共振能量转移（BRET）测定可以用作分子近似和/或相互作用的指标。 当具有与供体发射的适当光谱重叠的受体与供体近似时，产生显着的共振能量转移信号。 在所提供的例子中，用生物发光的海肾荧光素酶（Rlu）作为供体和作为受体的黄色荧光蛋白（YFP）标记的蛋白在细胞中共表达。 这对供体和受体具有4.4nm的近似Forster距离，提供了最佳的工作距离（Dacres et。，2010）。 这种技术可以用来探索在活细胞中发生的特定分子相互作用的时间过程。
【背景】使用生物发光供体和荧光受体的生物发光共振能量转移（BRET）研究可以监测在活细胞中实时发生的分子相互作用（例如标记的蛋白质，肽或小分子之间）。这种方法取决于供体和受体之间的空间近似，以及适当的光谱重叠以产生有意义的信号（图1）。目前提供的实例使用Rlu-标记的蛋白质作为供体和YFP-标记的蛋白质作为受体（Harikumar等人，2007）。这已被非常成功地应用于建立活细胞质膜中生理相关的蛋白质 - 蛋白质相互作用的存在。然而，重要的是包括可能导致非特异性蛋白质 - 蛋白质近似和能量转移（旁观者效应）的表达水平的对照，例如使用相似水平的已知非相关蛋白质的表达。此外，与未标记蛋白质的竞争可以帮助建立信号的相互作用的可饱和性和特异性。
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| Uptake Assays to Monitor Anthracyclines Entry into Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-09-20
[Abstract] Anthracyclines, such as doxorubicin and daunorubicin, are DNA damaging agents that autofluoresce and can be readily detected in cells. Herein, we developed suitable assays to quantify and localize daunorubicin in mammalian cells. These assays can be exploited to identify components that are involved in the uptake of anthracyclines.
[摘要] 蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，是DNA损伤剂，其可自发荧光并且可以容易地在细胞中检测到。 在这里，我们开发了合适的测定法来定量和定位哺乳动物细胞中的柔红霉素。 可以利用这些测定来鉴定参与蒽环类药物吸收的成分。
【背景】蒽环类药物，如多柔比星和柔红霉素，通过损伤DNA起作用，用于治疗各种类型的癌症，包括急性骨髓性白血病。当癌症患者被系统地给予蒽环类抗生素时，有几个因素限制了到达肿瘤部位的药物的量（Chauncey，2001; Deng等，2014; Riganti等，2015）。在肿瘤中，对癌细胞的药物活性受到药物吸收不良，药物流出过量以及细胞靶标变化的限制。几十年来，这些DNA损伤剂如何进入癌细胞还不清楚（Aouida等，2010; Cesar-Razquin等，2015; Zhang等，2015）。为了解决这个问题，我们开发了三种可靠的体外测定法来监测柔红霉素在细胞中的积累。这些测定中的两个是定量的，需要获得荧光活化细胞分选（FACS）口径和Fluoroskan仪器，第三个是使用落射荧光显微镜进行半定量。使用这些测定法，我们确定柔红霉素以时间和浓度依赖的方式进入细胞，并且每种细胞类型显示不同的摄取速率，这表明活性过程参与蒽环类药物的摄入（Andreev等人， ...
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| Optogenetic Stimulation and Recording of Primary Cultured Neurons with Spatiotemporal Control
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] We studied a network of cortical neurons in culture and developed an innovative optical device to stimulate optogenetically a large neuronal population with both spatial and temporal precision. We first describe how to culture primary neurons expressing channelrhodopsin. We then detail the optogenetic setup based on the workings of a fast Digital Light Processing (DLP) projector. The setup is able to stimulate tens to hundreds neurons with independent trains of light pulses that evoked action potentials with high temporal resolution. During photostimulation, network activity was monitored using patch-clamp recordings of up to 4 neurons. The experiment is ideally suited to study recurrent network dynamics or biological processes such as plasticity or homeostasis in a network of neurons ...
[摘要] 我们研究了文化中的皮层神经元网络，并开发了一种创新的光学装置，以空间和时间精确度激发大量神经元。 我们首先描述如何培养表达channelorhodopsin的原代神经元。 然后，我们将根据快速数字光处理（DLP）投影机的工作原理来详细说明光遗传设置。 该设置能够用独立的光脉冲训练数十到数百个神经元，以高时间分辨率诱发动作电位。 在光刺激期间，使用多达4个神经元的膜片钳记录监测网络活动。 该实验非常适合研究复杂的网络动力学或生物过程，如神经元网络中的可塑性或体内平衡，当子群体由其特征（相关性，速率和大小）进行精细控制的不同刺激激活时。
【背景】光致遗传学提供以毫秒精度控制神经元活动的平均值。然而，神经元通常通过同时激活整个群体的光的闪光或通过在整个视野上的时间调制强度的光同时激活（Boyden等人，2005）。然而，存在几种空间调节光并已被用于使谷氨酸不起作用的方法（Nawrot等人，2009）或激活表达神经元的通道视紫质（ChR2）（Guo等人，2009）（用于审查刺激神经元的可用方法具有空间和时间分辨率参见Anselmi等人，2015）。
为了获得刺激的空间控制，第一种可能性是使用激光并将其光束快速移动到不同位置。例如，通过用声光偏转器偏转激光束已经实现了在不同树枝状位置处的谷蛋白解冻（Shoham等人，2005）。只有我们在有限的区域内足够缓慢地调节光强度，这个策略才可能是可行的。或者，可以使用相位或强度的光调制器来实现光的空间图案。基于相位调制的全息技术允许以三维空间精度获得图像，但是可以以仅100Hz的速率显示图案（Papagiakoumou等人，2010）。如果二维图案是足够的，则可以通过将投影仪或阵列的LED放置在样品的共轭平面中来简单地获得强度调制（Farah等人，2007; ...
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