| CRISPR/Cas9 Gene Editing in the Marine Diatom Phaeodactylum tricornutum
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The establishment of the CRISPR/Cas9 technology in diatoms (Hopes et al., 2016; Nymark et al., 2016) enables a simple, inexpensive and effective way of introducing targeted alterations in the genomic DNA of this highly important group of eukaryotic phytoplankton. Diatoms are of interest as model microorganisms in a variety of areas ranging from oceanography to materials science, in nano- and environmental biotechnology, and are presently being investigated as a source of renewable carbon-neutral fuel and chemicals. Here we present a detailed protocol of how to perform CRISPR/Cas9 gene editing of the marine diatom Phaeodactylum tricornutum, including: 1) insertion of guide RNA target site in the diatom optimized CRISPR/Cas9 vector (pKS diaCas9-sgRNA), 2) ...
[摘要] 在硅藻（Hopes ，2016; Nymark等人，2016）中建立了CRISPR / Cas9技术，使得能够简单，廉价和有效地引入目标 这个非常重要的真核浮游植物群的基因组DNA的改变。 硅藻在纳米和环境生物技术领域从海洋学到材料科学，各种领域的示范性微生物都是有意义的，目前正在作为可再生碳中和燃料和化学品的来源进行调查。 在这里，我们提出了如何进行海洋硅藻三角褐指藻CRISPR / Cas9基因编辑的详细方案，包括：1）在硅藻优化的CRISPR / Cas9载体（pKS diaCas9）中插入引导RNA靶位点 -sgRNA），2）用于将pKS diaCas9-sgRNA质粒导入P的生物弹道转化。 三分支毛细胞和3）基于高分辨率熔融的PCR测定以筛选CRISPR / Cas9诱导的突变。
【背景】CRISPR / Cas9系统已被证明是许多真核生物中非常有效和成功的基因组编辑系统，现在也包括微藻（Hopes等人，2016; Nymark等人）。 ，2016; Shin 等人，2016）。 CRISPR / Cas9系统包括引导RNA（gRNA）和称为Cas9的核酸酶（Sander and Joung，2014）。 这两个分子形成复合物，其中gRNA将复合物引导至感兴趣的靶标。 ...
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| Serial Immunoprecipitation of 3xFLAG/V5-tagged Yeast Proteins to Identify Specific Interactions with Chaperone Proteins
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] This method was generated to isolate high affinity protein complexes from yeast lysate by performing serial affinity purification of doubly tagged 3xFLAG/V5 proteins. First, the bait protein of interest is immunoprecipitated by anti-FLAG-conjugated magnetic beads and gently eluted by 3xFLAG antigen peptide. Next, the bait protein is recaptured from the first eluate by anti-V5-conjugated magnetic beads and eluted with ionic detergent. In this manner, the majority of abundant, nonspecific proteins remain either bound to the first beads or in the first eluate, allowing pure, high affinity complexes to be obtained. This approach can be used to show specific interactions with notoriously ‘sticky’ chaperone proteins.
[摘要] 产生这种方法通过双重标记的3xFLAG / V5蛋白的连续亲和纯化来分离来自酵母裂解物的高亲和力蛋白质复合物。 首先，感兴趣的诱饵蛋白通过抗FLAG缀合的磁珠免疫沉淀，并用3xFLAG抗原肽轻轻洗脱。 接下来，通过抗V5共轭磁珠从第一洗脱液中回收诱饵蛋白质并用离子型洗涤剂洗脱。 以这种方式，大多数丰富的非特异性蛋白质仍然与第一珠粒或第一洗脱液结合，从而获得纯的高亲和性复合物。 这种方法可用于显示与臭名昭着的“粘滞”伴侣蛋白的特定相互作用。
【背景】通过质谱（IP / MS）进行免疫沉淀是鉴定与特定目标诱饵蛋白质的蛋白质 - 蛋白质相互作用的无偏见方法。虽然这种方法被有效地应用于鉴定蛋白质相互作用网络，但是它被假阳性困扰 - ...
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| Measuring Caenorhabditis elegans Sleep during the Transition to Adulthood Using a Microfluidics-based System
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] C. elegans sleep during development is regulated by genes and cellular mechanisms that are conserved across the animal kingdom (Singh et al., 2014; Trojanowski and Raizen, 2016). C. elegans developmental sleep is usually assessed during the transition to adulthood, a 2.6 h time interval called lethargus (Raizen et al., 2008; Singh et al., 2011). During lethargus, animals cycle between periods of immobility (sleep bouts) and periods of active locomotion (motion bouts). Sleep bouts resemble sleep in other species based on behavioral criteria, including cessation of feeding and locomotion, increased arousal threshold for response to sensory stimulation, rapid reversibility, and homeostatic response to sleep loss. Several assays have been developed ...
[摘要] C。发展过程中的线虫睡眠受到动物界保护的基因和细胞机制的限制（Singh等人，2014; Trojanowski和Raizen，2016）。 C。线虫发育睡眠通常在成年过渡期间进行评估，2.6h时间间隔称为lethargus（Raizen等人，2008; Singh等人， 2011）。在嗜睡期间，动物在不动的时期（睡眠开始）和积极运动时期（运动发作）之间循环。睡眠状态基于行为标准，包括停止进食和运动，增加唤醒阈值以响应感觉刺激，快速可逆性和对睡眠损失的稳态反应，类似于其他物种的睡眠。已经开发了几种用于在C中研究睡眠的测定法。 （Belfer等人，2013; Bringmann，2011; Nelson等人，2013; Raizen等人， 2008）。在这里，我们提供了一个详细的评估方案。线虫在lethargus期间睡眠，许多研究组已经成功使用，结合简单的微流体室，具有照明系统的低成本照相机和基于图像减法的计算分析。我们注意到，这个系统可以很容易地适应于评估任何小动物的睡眠。
背景 C。睡眠通常根据运动停止进行评估，这是整个动物界睡眠的常见特征。由于C期间睡眠发作的间歇性。线虫发育睡眠，计算机视觉通常用于跟踪C的活动。线虫在lethargus期间。动物被约束到单个焦平面以保持它们的焦点。因为C.线虫可以通过长时间的游泳用尽液体（Ghosh和Emmons，2008），C。线虫 ...
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