| Confocal Microscopy of Reovirus Transport in Living Dorsal Root Ganglion Neurons
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Author:
Date:
2020-11-20
[Abstract] Neurotropic reoviruses repurpose host machinery to traffic over long distances in neuronal processes and access distal replication sites. Understanding mechanisms of neuronal transmission is facilitated by using simplified in vitro primary neuronal culture models. Advances in the design of compartmentalized microfluidic devices lend robustness to neuronal culture models by enabling compartmentalization and manipulation of distinct neuronal processes. Here, we describe a streamlined methodology to culture sensory neurons dissociated from dorsal root ganglia of embryonic rats in microfluidic devices. We further describe protocols to exogenously label reovirus and image, track, and analyze transport of single reovirus particles in living neurons. These techniques can be adapted to study ...
[摘要] [摘要] 嗜神经性呼肠孤病毒重新利用宿主机器在神经元过程中进行长距离的传输，并进入远端复制部位。简化的体外原代神经元培养模型有助于理解神经元传递机制。室化微流控装置设计的进展使得不同的神经元过程能够被划分和操作，从而为神经元培养模型提供了稳健性。在这里，我们描述了一种在微流控装置中培养胚胎大鼠背根神经节分离的感觉神经元的方法。我们进一步描述了外源性标记呼肠孤病毒的方法，并对单个呼肠孤病毒粒子在活神经元中的转运进行了成像、跟踪和分析。这些技术可应用于研究其他嗜神经病毒的轴突定向转运以及参与信号传导和病理学的神经因子。
[背景]来自不同家族的病毒，包括黄病毒科、疱疹病毒科、小角RNA病毒科和弹状病毒科，突破神经系统的保护屏障，造成严重的疾病和经济负担（Koyuncu等人，2013年；Bohmwald等人，2018年；Tyler，2018年）。哺乳动物正呼肠孤病毒（reovirus，reovirus）属于呼肠孤病毒科，在多种年轻哺乳动物中引起血清型依赖性神经元感染，可导致致命性脑炎（Tyler等人，1986年；Dermody等人，2013年）。呼肠孤病毒没有被两个同心蛋白壳包裹的片段dsRNA基因组包裹，是研究神经系统病毒感染的一种灵活工具（Dermody等人，2013年）。虽然呼肠孤病毒感染的细胞和分子机制已被广泛地利用转化细胞系进行研究，但这些系统并不能捕捉到极化神经元细胞的复杂性。感染神经元的病毒必须在轴突中长距离传播，才能到达复制和释放的远端。为了了解呼肠孤病毒进入神经元和长距离运输的机制，我们最近采用了一些技术来培养原代神经元，并对活细胞中荧光标记的呼肠孤病毒成像（Aravamudhan等人，2020年）。 ...
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| Isolation and ex vivo Expansion of Human Limbal Epithelial Progenitor Cells
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Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Limbal stem cell transplantation has been used successfully to treat patients with limbal stem cell deficiency all over the world. However, long term clinical results often proved less satisfactory due to the low quality of the graft or inadequate properties of transplanted cells. To enhance the ex vivo expansion of human limbal epithelial stem or progenitor cells (LEPC) by preserving stem cell phenotype and to improve subsequent transplantation efficiency, cell-matrix interactions ex vivo should mimic the condition in vivo. The laminin isoforms preferentially expressed in the limbal niche can be used as a culture matrix for epithelial tissue engineering. We recently published the expansion of LEPC on various laminin isoforms and observed that laminin alpha ...
[摘要] [摘要] 角膜缘干细胞移植已成功用于治疗角膜缘干细胞缺乏症的患者。但是，由于移植物质量低或移植细胞特性不足，长期临床结果常常不能令人满意。为了通过保留干细胞表型来增强人角膜缘上皮干细胞或祖细胞（LEPC）的体外扩增，并提高后续移植效率，离体细胞-基质相互作用应模拟体内条件。在角膜缘利基中优先表达的层粘连蛋白同工型可以用作上皮组织工程的培养基质。我们最近发表了LEPC在各种层粘连蛋白同工型上的扩增，并观察到与组织培养板和其他层粘连蛋白同工型相比，层粘连蛋白α5衍生的基质通过保留干/祖细胞表型，支持LEPC的有效扩增。在这里，我们描述了通过重组人层粘连蛋白-511 E8片段（LN-511E8）作为培养底物，通过胶原酶消化和LEPC的有效扩增从尸体角膜缘组织分离LEPC的优化方案。
[背景] 角膜上皮干/祖细胞（LEPC）负责角膜上皮的持续更新，位于高度专业化和复杂的环境中。它包括特定的细胞外基质组分和在支撑角膜缘细胞小生corneo -scleral缘（Schermer 等人，1986; Cotsarelis 。等人，1989; 奥多涅斯。等人，2012 ;梅。等人，2012）。这种干/祖细胞储库的损坏或损伤可导致角膜新生血管形成，慢性炎症和与角膜混浊和视力丧失相关的基质瘢痕形成（Kenyon和Tseng，1989； Sangwan 和Tseng ...
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| Isolation of LYVE-1+ Endothelial Cells from Mouse Embryos
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1, or LYVE-1, is a type 1 integral membrane glycoprotein expressed by lymphatic endothelial cells (LECs). LYVE-1 is commonly used as a biological marker to visually distinguish developing lymphatic vessels from blood endothelial cells (arteries or veins). As our understanding of lymphatic biology is still lacking today, the need to isolate LECs apart from other endothelial cells has taken on greater importance. The following procedure describes a magnetic bead separation procedure for isolating LEC-rich populations of cells from developing mouse embryos.
[摘要] 淋巴管内皮透明质酸受体1或LYVE-1是由淋巴管内皮细胞（LEC）表达的1型整合膜糖蛋白。 LYVE-1通常用作生物标记物，以在视觉上区分发育中的淋巴管与血液内皮细胞（动脉或静脉）。 由于我们今天仍然缺乏对淋巴生物学的理解，因此将LEC与其他内皮细胞分离的必要性变得更加重要。 以下程序描述了用于从发育中的小鼠胚胎中分离富含LEC的细胞群的磁珠分离程序。
【背景】淋巴脉管系统形成二次循环系统，其起到从组织排出细胞外液的作用，允许脂质的转运，并提供免疫细胞运输和运输功能。虽然我们对淋巴系统的理解在过去的几十年中迅速扩大，但与我们对动脉和静脉生物学的了解相比，它仍然缺乏。 LECs鉴定LYVE-1受体表达提供了区分淋巴组织的有用工具，但已知LYVE-1在其他组织中表达，包括肝和脾窦状细胞和胰腺外分泌和朗格汉斯细胞胰岛（Banerji et al。，1999）。由LYVE1基因编码，LYVE-1受体的生物学功能尚未确定，但除了跨内皮细胞的HA转运外，还有人建议参与肿瘤转移（Jackson，2003）。尽管LYVE-1在多种组织中表达，但它仍然是目前用于区分LEC与其他内皮细胞的常用标记物。该方法的目的是使用与LYVE-1抗体偶联的dynabeads以正选择方法从发育中的小鼠胚胎中分离LEC。
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