| Thermal Stability of Heterotrimeric pMHC Proteins as Determined by Circular Dichroism Spectroscopy
|
|
Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] T cell receptor (TCR) recognition of foreign peptide fragments, presented by peptide major histocompatibility complex (pMHC), governs T-cell mediated protection against pathogens and cancer. Many factors govern T-cell sensitivity, including the affinity of the TCR-pMHC interaction and the stability of pMHC on the surface of antigen presenting cells. These factors are particularly relevant for the peptide vaccination field, in which more stable pMHC interactions could enable more effective protection against disease. Here, we discuss a method for the determination of pMHC stability that we have used to investigate HIV immune escape, T-cell sensitivity to cancer antigens and mechanisms leading to autoimmunity.
[摘要] 由肽主要组织相容性复合物（pMHC）提供的外源肽片段的T细胞受体（TCR）识别控制T细胞介导的针对病原体和癌症的保护。 许多因素控制T细胞敏感性，包括TCR-pMHC相互作用的亲和力和pMHC在抗原呈递细胞表面的稳定性。 这些因素对于肽疫苗接种领域尤其重要，其中更稳定的pMHC相互作用可以实现更有效的防止疾病的保护。 在这里，我们讨论一种测定pMHC稳定性的方法，我们已经用来调查HIV免疫逃逸，T细胞对癌症抗原的敏感性和导致自身免疫的机制。
【背景】CD8 + T细胞对外来入侵者或失调自身的反应的能力取决于细胞表面上稳定的pMHC I类（pMHCI）表达。在结构上，MHCI分子在α1和α2结构域之间的界面处形成由两个平行的α螺旋形成的肽结合槽，其具有β片的底部（Latron等人，1992）。肽结合槽具有与结合肽的N-和C-末端紧密相互作用的特异性氨基酸的主要肽结合口袋（B和F）。虽然这些口袋可以适应一系列氨基酸，但它们表现出对使用结构和生物化学方法表征的某些侧链的偏好（Parker等人，1992）。该信息已被用于产生所谓的“异型”肽，其中具有差的MHC锚的天然肽可以用与MHC最佳结合的氨基酸进行修饰（Cole等人，2010 ...
|
|
|
| Determination of Hydrodynamic Radius of Proteins by Size Exclusion Chromatography
|
|
Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] Size exclusion chromatography (SEC) or gel filtration is a hydrodynamic technique that separates molecules in solution as a function of their size and shape. In the case of proteins, the hydrodynamic value that can be experimentally derived is the Stokes radius (Rs), which is the radius of a sphere with the same hydrodynamic properties (i.e., frictional coefficient) as the biomolecule. Determination of Rs by SEC has been widely used to monitor conformational changes induced by the binding of calcium (Ca2+) to many Ca2+-sensor proteins. For this class of proteins, SEC separation is based not just on the variation in protein size following Ca2+ binding, but likely arises from changes in the hydration shell structure.
This ...
[摘要] 尺寸排阻色谱法（SEC）或凝胶过滤是一种流体动力学技术，它将溶液中的分子作为其尺寸和形状的函数。在蛋白质的情况下，可以通过实验得出的流体动力学值是斯托克斯半径（R s），它是具有相同流体力学性质的球体的半径（即， >摩擦系数）作为生物分子。通过SEC测定R s已经被广泛用于监测由钙（Ca 2+）与许多Ca 2+连接引起的构象变化传感器蛋白。对于这类蛋白质，SEC分离不仅基于Ca 2 + 结合后的蛋白质尺寸变化，而且可能来自水合壳结构的变化。
该方案旨在使用快速蛋白质液相色谱（FPLC）系统对预填充柱进行凝胶过滤实验，以确定蛋白质的R 1，其中一些适用于Ca 2 + 传感器蛋白。
凝胶过滤基于其相对的能力分离不同大小和形状的分子，以穿透具有明确孔径的多孔珠床，其识别分馏范围。大于完全排除进入孔隙的分馏范围的分子快速流过色谱柱，首先以空间体积（V 0 O）（其为支持颗粒外的间隙体积）洗脱。能够扩散到珠的孔中的小于分级范围的分子具有可用于流动相的总体积，因此它们更缓慢地移动通过床并最后洗脱。具有中等维度的分子将以包含在流动相可利用的空隙体积和总体积之间的洗脱体积（V e e e e）被洗脱（分子越小，其进入孔隙越大矩阵，因此其V e e越大）。
蛋白质的分子量可以通过比较其洗脱体积参数K ...
|
|
|
| Rubisco Extraction and Purification from Diatoms
|
|
Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] This protocol describes a method to extract ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase oxygenase (Rubisco) from diatoms (Bacillariophyta) to determine catalytic performance. This protocol has been adapted from use in cyanobacteria and higher plants (Andrews, 1988; Whitney and Sharwood, 2007). First part (steps A1-A3) of the extraction provides a crude extract of Rubisco that is sufficient for carboxylation assays to measure the Michaelis constant for CO2 (KC) and the catalytic turnover rate (kcatc). However, the further purification steps outlined (steps B1-B4) are needed for measurements of Rubisco CO2/O2 Specificity (SC/O, [Kane et al., 1994]).
[摘要] 该方案描述了从硅藻（“芽孢杆菌”）提取核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco）的方法以确定催化性能。该方案已经在蓝细菌和高等植物中得到了应用（Andrews，1988; Whitney and Sharwood，2007）。提取的第一部分（步骤A1-A3）提供Rubisco的粗提取物，其足以用于羧化测定以测量CO 2（K 3 C）的Michaelis常数和催化更换率（ k c ）。然而，为了测量Rubisco CO 2 / O 2特异性（S C / O ）需要进一步的纯化步骤（步骤B1-B4） >，[Kane等人，1994]）。背景 核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶加氧酶（Rubisco，EC 4.1.1.39）催化了CO 2光合同化的第一步，因此在光合作用和全球碳循环中起着重要的作用。 Rubisco已经从古菌，细菌，藻类和植物的各种生物体中分离出来，并且在生物体之间显示出各种各样的动力学（Galmes等人，2014年; Tcherkez等人，2006; Whitney等人，2011）。 Rubisco动力学的知识是了解光合作用以及因此碳的生物沉积物对人为CO ...
|
|
|