| Isolation and Culture of Mouse Lung ILC2s
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Group 2 Innate Lymphoid Cells (ILC2) play an important role in immune responses at barrier surfaces, notably in the lung during airway allergic inflammation or asthma. Several studies have described methods to isolate ILC2s from wild-type naive mice, most of them using cell sorting to obtain a pure population. Here, we describe in detail, a simple, efficient method for isolation and culture of lung mouse ILC2s. Lungs from Rag2-/- mice pretreated with IL-33 are collected and processed into single cell suspensions. Lymphoid cells are then recovered by density gradient separation. Lin-CD45+ cells are selected by depletion of lineage positive cells followed by positive selection of CD45+ cells. Culture of the isolated cells for several days ...
[摘要] 第2组先天性淋巴细胞（ILC2）在屏障表面，特别是在气道过敏性炎症或哮喘期间的肺中的免疫应答中起重要作用。一些研究已经描述了从野生型幼稚小鼠中分离ILC2的方法，其中大多数使用细胞分选来获得纯种群。在这里，我们详细描述了一种简单有效的肺小鼠ILC2分离和培养方法。收集用IL-33预处理的 Rag2 - / - 小鼠的肺并加工成单细胞悬浮液。然后通过密度梯度分离回收淋巴样细胞。通过耗尽谱系阳性细胞然后阳性选择CD45 + 细胞来选择Lin - CD45 + 细胞。将分离的细胞培养数天导致高度纯化的ILC2群体表达典型的细胞表面标志物（CD90.2，Sca1，CD25，CD127和IL-33R）。这些细胞可在培养物中扩增长达10天，并用于多种离体测定或体内过继转移实验。
【背景】第2组先天性淋巴细胞（ILC2）是组织驻留细胞，其在抗寄生虫先天免疫以及过敏性炎症的发展中起关键作用。它们通过产生大量的2型细胞因子IL-5和IL-13对上皮细胞衍生的细胞因子如白细胞介素-33（IL-33）起反应，后者又诱导嗜酸性粒细胞增多和粘液产生（Cayrol和Girard，2018）。为了更好地表征这些细胞的功能和调节，许多组通过荧光激活细胞分选（FACS）从野生型小鼠（WT）的肺中分选ILC2。由于稳定状态下肺中存在的ILC2数量较少，因此该方法导致纯化细胞的产量较低（每只小鼠1×10 ...
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| Visualization of RNA at the Single Cell Level by Fluorescent in situ Hybridization Coupled to Flow Cytometry
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] The protocol described here has been developed to detect RNA at the single cell level. Fluorescent probes hybridize to target RNAs and are detected by flow cytometry after multiple amplification steps. Different types of RNA can be detected such as mRNA, long noncoding RNA, viral RNA or telomere RNA and up to 4 different target probes can be used simultaneously. We used this protocol to specifically measure the expression of two transcription factor mRNAs, MAFB and IRF4, in human monocytes.
[摘要] 这里描述的方案已经被开发用于在单细胞水平上检测RNA。 荧光探针与目标RNA杂交，并在多个扩增步骤后通过流式细胞术检测。 可以检测不同类型的RNA，例如mRNA，长的非编码RNA，病毒RNA或端粒RNA，并且可以同时使用多达4种不同的靶探针。 我们使用该方案来特异性测量人单核细胞中两种转录因子mRNA，MAFB和IRF4的表达。
【背景】RT-qPCR是用于轻松评估RNA表达的一种主要技术。将细胞裂解并批量分析。因此，细胞异质性丧失。特别是，使用RT-qPCR来解决是否可以基于RNA的表达来鉴定亚群是不可能的。 RNA荧光原位杂交（FISH）是一种检测单细胞RNA的方法。该技术需要RNA靶标上的荧光探针杂交，然后使用成像系统如共聚焦显微镜检测。但是，这种方法非常耗时，并且可以分析有限数量的单个细胞。
我们通过RT-qPCR证实，在具有M-CSF，IL-4和TNFα的RPMI中培养的人单核细胞在三小时后表达转录因子MAFB和IRF4（Goudot等人，2017）。 MAFB和IRF4分别参与单核细胞向单核细胞衍生的巨噬细胞（mo-mac）和单核细胞衍生的DC（mo-DC）的分化。为了破译单核细胞是否表达两种转录因子，或者如果这种表达是互斥的，我们使用PrimeFlow RNA测定法进行与流式细胞术偶联的原位杂交。
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| MHC Class II Tetramer Labeling of Human Primary CD4+ T Cells from HIV Infected Patients
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Author:
Date:
2017-03-20
[Abstract] Major Histocompatibility Complex (MHC) tetramers have been used for two decades to detect, isolate and characterize T cells specific for various pathogens and tumor antigens. In the context of Human Immunodeficiency Virus (HIV) infection, antigen-specific CD8+ T cells have been extensively studied ex vivo, as they can be readily detected by HIV peptide-loaded MHC class I tetramers. In contrast, the detection of HIV-specific CD4+ T cells has proven more challenging, due to the intrinsically lower clonal expansion rates of CD4+ T cells, and to the preferential depletion of HIV-specific CD4+ T cells in the course of HIV infection.
In the following protocol, we describe a simple method that facilitates the identification of CD4+ ...
[摘要] 主要组织相容性复合物（MHC）四聚体已经使用二十年来检测，分离和表征各种病原体和肿瘤抗原特异性的T细胞。在人类免疫缺陷病毒（HIV）感染的背景下，抗原特异性CD8 +细胞已经在体外广泛研究，因为它们可以容易地被HIV肽 - 加载MHC I类四聚体。相比之下，HIV特异性CD4 + sup + T细胞的检测已被证明更具挑战性，因为CD4 + sup + T细胞的本质上较低的克隆扩增率以及优先艾滋病毒感染过程中艾滋病毒特异性CD4 + T细胞的消耗。＆nbsp;在以下协议中，我们描述了一种简单的方法，该方法有助于使用肽负载的MHC II类四聚体来鉴定HIV-1衣壳表位特异性的CD4 + / T细胞。可以分析四聚体标记的CD4 T细胞的细胞表面表型和/或FACS分选用于进一步的下游应用。成功检测特异性CD4 + / / T细胞离体的关键是选择导致高亲和力T细胞受体（TCR）的肽/ MHC II组合， （Benati等人，2016）。 MHC II四聚体阳性细胞的可靠检测的第二个关键点是系统地使用负载无关肽的对照四聚体，样品和对照管在相同的条件下进行处理。背景 在用抗PE微珠对四聚体-PE标记的细胞进行磁力富集后，在纯化的CD4 + T细胞中检测到罕见的HIV特异性MHC II四聚体阳性细胞（Seth等人， em>。，2005）。我们发现使用经验证的肽/ MHC ...
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