| Hypoxia Reporter Element Assay
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Author:
Date:
2018-08-05
[Abstract] Hypoxia is a condition in which there is a decrease in oxygen supply to the cellular environment. Changes to cellular oxygen levels can lead to transcriptional changes of oxygen-regulated genes. Reporter assays are used to study gene expression alteration and modifications in response to environmental changes. Dual-reporter assays allow the simultaneous measurement of two different genes within a single cell, thus improving experimental accuracy. Within this protocol, we describe the utilization of the LightSwitch Dual Assay System to measure BMX expression in response to hypoxic conditions.
[摘要] 缺氧是细胞环境中氧供应减少的一种情况。 细胞氧水平的变化可导致氧调节基因的转录变化。 报告分析用于研究响应环境变化的基因表达改变和修饰。 双报告分析允许同时测量单个细胞内的两个不同基因，从而提高实验准确性。 在该协议中，我们描述了LightSwitch双重测定系统的使用，以测量响应缺氧条件的BMX表达。
【背景】在我们最近的出版物（van Oosterwijk et al。，2018）中，我们试图检测BMX（一种非受体酪氨酸激酶）对索拉非尼治疗的反应。 BMX是一种Tec激酶家族成员，已知与酪氨酸磷酸化蛋白结合并通过与磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸结合而介导膜靶向（PIP3; Chen 等人，2013）。我们发现索拉非尼在有或没有基质细胞支持的急性髓性白血病（AML）细胞系中的直接治疗对BMX的上调没有贡献。以前的研究表明缺血可诱导BMX表达，索拉非尼具有抗血管生成活性（He et al。，2006; Davis et al。，2011）。因此，我们假设索拉非尼的抗血管生成活性导致骨髓内的缺氧环境，从而导致AML中缺氧依赖性BMX上调。在缺氧条件下，我们能够显示许多不同细胞系中BMX表达的显着增加。 BMX启动子的进一步分析在-5005处鉴定出推定的缺氧反应元件（HRE; ...
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| Creating a RAW264.7 CRISPR-Cas9 Genome Wide Library
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome editing tools are used in mammalian cells to knock-out specific genes of interest to elucidate gene function. The CRISPR-Cas9 system requires that the mammalian cell expresses Cas9 endonuclease, guide RNA (gRNA) to lead the endonuclease to the gene of interest, and the PAM sequence that links the Cas9 to the gRNA. CRISPR-Cas9 genome wide libraries are used to screen the effect of each gene in the genome on the cellular phenotype of interest, in an unbiased high-throughput manner. In this protocol, we describe our method of creating a CRISPR-Cas9 genome wide library in a transformed murine macrophage cell-line (RAW264.7). We have employed this library to identify novel mediators in the caspase-11 ...
[摘要] 细菌聚集的定期交织的短回文重复（CRISPR）-Cas9基因组编辑工具用于哺乳动物细胞敲除感兴趣的特定基因以阐明基因功能。 CRISPR-Cas9系统要求哺乳动物细胞表达Cas9核酸内切酶，引导RNA（gRNA）引导内切核酸酶到目的基因，以及连接Cas9与gRNA的PAM序列。使用CRISPR-Cas9基因组宽的文库以无偏倚的高通量方式筛选基因组中每个基因对感兴趣的细胞表型的影响。在本协议中，我们描述了我们在转化的鼠巨噬细胞细胞系（RAW264.7）中创建CRISPR-Cas9基因组文库的方法。我们已经使用该文库来鉴定胱天蛋白酶-11细胞死亡途径中的新型介质（Napier等人，2016）;然而，该文库可用于筛选特定基因在多种鼠巨噬细胞通路中的重要性。
背景 历史上，使用RNA干扰（RNAi）或源自敲除小鼠的细胞，了解特定基因对真核细胞中感兴趣的表型的贡献是可能的。然而，在过去几年中，新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9已经允许在真核细胞内容易且有效地产生敲除细胞系和全基因组筛选。 CRISPR-Cas9基因组范围的筛选扩大了哺乳动物遗传学的工具箱和新型蛋白质的鉴定及其对特定表型的贡献。使用这种方法，研究人员已经能够鉴定参与肿瘤生长的新基因（Chen等人，2015; Kiessling等人，2016; Steinhart ...
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| Robust Generation of Knock-in Cell Lines Using CRISPR-Cas9 and rAAV-assisted Repair Template Delivery
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] The programmable Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated nuclease 9 (Cas9) technology revolutionized genome editing by providing an efficient way to cut the genome at a desired location (Ledford, 2015). In mammalian cells, DNA lesions trigger the error-prone non-homologous end joining (NHEJ) DNA repair mechanism. However, in presence of a DNA repair template, Homology-Directed Repair (HDR) can occur leading to precise repair of the lesion site. This last process can be exploited to enable precise knock-in changes by introducing the desired genomic alteration on the repair template. In this protocol we describe the delivery of long repair templates (> 200 nucleotides) using recombinant Adeno Associated Virus (rAAV) for CRISPR-Cas9-based knock-in of a ...
[摘要] 可编程集群定期间隔短回归度（CRISPR）相关核酸酶9（Cas9）技术通过提供在所需位置切割基因组的有效方式，彻底改变了基因组编辑（Ledford，2015）。 在哺乳动物细胞中，DNA损伤触发易发生非同源末端连接（NHEJ）DNA修复机制。 然而，在DNA修复模板的存在下，可以发生同源性定向修复（HDR），导致病变部位的精确修复。 可以利用最后的方法，通过在修复模板上引入所需的基因组改变来实现精确的敲入变化。 在本协议中，我们描述了使用重组腺相关病毒（rAAV）在人细胞系中进行基于CRISPR-Cas9的C-末端标签序列敲入的长修复模板（> 200个核苷酸）的递送。
尽管有关CRISPR-Cas9产生的敲门模型系统的大量报告，敲门砖报告仍然落后。由于许多应用，产生敲入细胞系仍然是基因组编辑的明显目标。敲入改变的引入通常依赖于修复模板DNA的存在，并且在位点特异性双链（ds）DNA断裂被引入接近改变位点的基因组中后，HDR修复机制的激活。不同的模板可以传送到修复机器，范围从含有广泛同源区域和可选选择盒的经典线性化载体到约200个核苷酸的单链（ss）DNA寡核苷酸（Chen等人， ...
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